Поскольку в функционировании костномозговых и тимусных ниш большое значение имеют мембранные взаимодействия, проведены эксперименты по изучению влияния на противорадиационную активность ГСК преинкуби-рования их с МСК тимуса. Как видно из представленных в табл. данных, после инкубации с МСК активность КФПм и КФПч значительно возрастала, что может свидетельствовать в пользу вышеизложенного предположения.
Выводы. 1. Средняя продолжительность жизни летально облученных мышей СВА увеличивается после внутривенного введения 0,5*106 клеток сингенной (13-14 день геста-ции) или человеческой печени 9-ти недель ге-стации, а также 104 сингенных МСК тимуса.
2. В значительно большей степени средняя продолжительность жизни летально облученных мышей увеличивается в результате введения им клеток сингенной или ксеногенной фетальной печени, преинкубированных ex vivo с МСК тимуса.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ярилин А. А. М.: ГЭОТАР-Медиа 2010, 752 с.
2. Bifari F., Lisi V., Mimiola E., Pasini A., Krampera M. Transfus Med Hemother. 2008, 35, 194-204.
3. Chao Shi. Immunology 2012, 136, 133-138.
4. Le Blanc K., Mougikakos D. Immunology 2012, 12, 383-396.
5. Anklesaria P., Kase K., Glowacki J., Holland C. A., Sakakeeny M. A., et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 1987,84, 7681-7685.
COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF THE HEMATOPOIETIC
AND MULTIPOTENT STROMAL CELL ACTIVITY FOR BONE MARROW SYNDROME MANAGEMENT IN LETHALLY IRRADIATED MICE
Nikolskaya E. I., Taranukha L. I., Halytska S. N., Nikolskaya V. V., Nikolsky I. S.
Institute of Genetic and Regenerative Medicine of NAMS, Kyiv, Ukraine
The average life expectancy of lethally irradiated CBA mice increased after intravenous administration of 0.5*106 cells of syngeneic (gestation day 13-14) or 9-weeks' gestation human liver, and 106 syngeneic thymic MSCs. More significantly a life expectancy of lethally irradiated mice increased by administration of syngeneic or xenogeneic fetal liver cells preincubated ex vivo with MSCs.
Key words: irradiation, multipotent stromal cells, hematopoietic stem cells
МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА ПРОТЕГРИНА-1
Орлов Д. С.1,3, Артамонов А. Ю.1, Орлов С. Б.2
'ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, Санкт-Петербург,
2Саратовский государственный медицинский университет; 3Санкт-Петербургский государственный университет, Россия
Полифункциональные антибиотические пептиды системы врожденного иммунитета рассматриваются как платформа создания лекарственных веществ нового поколения. Перспективным является ранее выделенный нами из лейкоцитов свиньи протегрин-1 (ПГ). С помощью метода подсчета колоний, хромогенных маркеров проницаемости бактериальных мембран, ионселективного электрода была изучена антимикробная активность ПГ и его спобность повреждать барьерную функцию мембран Б.соН ML-35p. Антимикробное действие ПГ, начиная от 0,95 мкг/мл, сопровождалось повреждением внешней и внутренней бактериальных мембран, утечкой внутриклеточного калия. Эффекты ПГ подавлялись в концентрационно-зависимой манере ионами La3+ (1-10 мМ) эффективными заместителями Са2+ в мембранных структурах. Мы предпологаем, что формирование более прочных комплексов, не снижая жизнеспособности бактерий, делала их резистентными к ПГ. Полученные данные свидетельствуют о мембранолитическом механизме антибиотической активности ПГ и защитной функциональной роли природных дивалентных катионов бактериальных мембран.
Ключевые слова: врожденный иммунитет, антимикробные пептиды
В основе защитных функций системы врожденного иммунитета человека и животных лежат молекулярно-клеточные механизмы эффекторного и регуляторного действия пептидов, вырабатываемых лейкоцитами и клетками барьерных эпителиев. Антимикробные пептиды (АП) обладают уникальной совокупностью биологических свойств: противомикробной, противовирусной и противоопухолевой активностью. Отличительными чертами бактерицидного действие АП являются отсутствие развития резистентности микроорганизмов и им-муносупрессии, что выгодно отличает их от противоинфекционных средств, применяемых в клинике. Таким образом, АП могут рассматриваться как перспективная основа для создания антибиотиков нового поколения [1]. Для обеспечения оптимального применения их в медицине необходимо изучение молекулярно-клеточных основ их биологических эффектов. В настоящее время остаются малоизученными механизмы действия АП на мембраны микроорганизмов. АП являются катионными, амфифильными молекулами, антимикробное действие многих из них основано на способности нарушать барьерную функцию бактериальных мембран. Молекулярные механизмы мембрано-тропных эффектов АП интенсивно изучаются. Известно, что структуру бактериальных мембран стабилизируют катионы металлов. Во внешней мембране грамотрицательных микроорганизмов они служат связующим звеном между фосфатными группами молекул липополисахаридов, связывая их в единую устойчивую структуру. Установлено, что повышение концентраций ионов кальция и магния способно снижать бактерицидное действие АП. Сделано предположение, что важнейшим условием бактерицидного действие является конкурентное вытеснение их из мембранных структур [2].
Целью настоящей работы было изучение механизма антимикробной активности ранее открытого нами антимикробного пептида лейкоцитов свиньи протегрина-1 (ПГ-1) [3] и его зависимости от присутствия в среде ионов лантана - эффективного заместителя кальция и образующего более устойчивые соединения.
Материал и методы. Эксперименты были проведены на Escherichia coli штамм ML-35p,
любезно предоставленной проф. Р. Лере-ром из Калифорнийского университета Лос-Анжелеса, США. Особенность штамма заключается в наличии и специфической внутриклеточной локализации ферментов -периплазматической (3-лактамазы и цито-плазматической (3-галактозидазы. Бактерий культивировали в чашках Петри на твердой питательной среде (агарозном геле) с содержанием 3% триптического гидролизата сои (TSB) (Sigma-Aldrich) и 50 мкг/мл ампицили-на. После посева бактерий на твердую питательную среду чашки Петри помещали в термостат на 16-18 часов при температуре 37°С. По истечении этого времени чашки Петри помещали для хранения в холодильник. Для каждого эксперимента культуру бактерий пересеивали с твердой питательной среды с помощью микробиологической петли и культивировали в жидкой питательной среде в течение 16-18 часов при температуре 37°С. Жидкая среда представляет собой 20 мл раствора TSB, полученного растворением 30 г сухого порошка TSB в 1 л дистиллированной воды. Непосредственно перед экспериментом 5 мл суспензии бактерий отмывали 4 раза в 10 мМ TRIS-ацетатном буфере с содержанием 100 мМ хлорида натрия (№С1), (рН 7,4). Процедура отмывания включала в себе центрифугирование при 5000 об/мин в течение 4 мин и ресуспензирование в 5 мл 10 мМ TRIS-ацетатного буфера с содержанием 100 мМ №С1. Концентрация бактерий в суспензии составляла 2,5 х 108 КОЕ/мл, что соответствует оптической плотности 1.0 на длине волны 620 нм. До использования в эксперименте суспензия бактерий хранилась на льду. Для оценки бактерицидного действия использовали метод подсчета колоний [4]. Суспензии бактерий рассеивали на твердую питательную среду (агарозный гель с содержанием 3% триптического ги-дролизата сои (TSB) (Sigma-A1drich) в чашках Петри. На твердую питательную среду производился посев суспензии бактерий в 10 мМ TRIS-ацетатном буфере с 100 мМ №С1, рН 6,5 - контроль или инкубированной в пробирке а) с пептидом, б) с пептидом и La3+ в) с La3+. Из каждой пробирки для посева брали 40 мкл рабочего раствора через 0.5 мин, 30 мин. и 60 мин. инкубации. Общий объем суспензии составлял 200 мкл, компонентами являлись: 10 мМ TRIS-ацетатный
буфер с 100 мМ NaCl (pH 7,4) и суспензия бактерий E.coli (2,5 х 107 КОЕ/мл), находящихся в стационарной фазе. В зависимости от цели эксперимента в рабочий раствор добавлялся антимикробный пептид ПГ-1 (8,2 мкг/мл) и/ или LaCl3 (10 мкМ). После посева бактерий на твердую питательную среду чашки Петри помещали в термостат на 18 часов и инкубировали при температуре 37 °C. После 18 ч инкубации производился подсчет проросших колоний, выросших из жизнеспособных бактерий. Для оценки способности ПГ-1 нарушать барьерную функцию бактериальных мембран был использован разработанный нами фотометрический метод [5]. E. coli ML-35p имеет ферменты специфической локализации - периплазматическую ß-лактамазу и цитоплазматическую ß-галактозидазу. ß-лактамаза способна гидролизовать нитро-цефин (3-(2,4-динитростирил)-(6R,7R)-7-(2-тиенолацетамидо)-цеф-3ем-4-кар боксиловая кислоту (Calbiochem-Novabiochem) с образованием хромогенного продукта реакции с максимумом поглощения на длине волны X = 490 нм, а ß-галактозидаза гидролизует ONPG (о-нитрофенил-бета-Б-галактопиранозид, Sigma-Aldrich), продукт реакции поглощает на длине волны X = 420 нм. Если мембраны бактерий интактны, то субстраты не проникают в микроорганизмы, продукты реакций не образуются. Если мембраны повреждены, субстраты проникают внутрь клетки и образование продуктов может быть фотометрически измерено в реальном времени.
Для регистрации использовали спектрофотометр SpectraMAX250 (Molecular Devices Corp. USA). Общий объем растворов в каждой лунке составлял 100 мкл. Каждая лунка содержала: 10 мМ TRIS-ацетатный буфер с 100 мМ NaCl (pH 7,4); 79 мкМ нитроцефина или 2,25 мМ ONPG (в зависимости от цели исследования - внешней или внутренней мембраны); 8,2 мкг/мл пептида ПГ-1; различные концентрации LaCl3 (5-20 мкМ); 2,5 х 107 КОЕ/мл E. coli, находящейся в стационарной фазе. Перед добавлением пептида планшет был поставлен в термостат на 10 мин при температуре 37 °C для преинкубации с ионами лантана. Барьерная функция мембран микроорганизмов оценивалась также по утечке внутриклеточного калия, определяемого электрохимически с помощью разработанного нами ранее метода [6].
Измерения проводились с помощью милливольтметра, предназначенного для работы с электродами, и ионселективного калиевого электрода MI-442 (Microelectrodes Inc., США) и электрода сравнения SDR-2 (World
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.