ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2009, том 51, № 3, с. 377-386
РАСТВОРЫ
УДК 541(64+24):539.199:532.5
МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ, ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ И КОНФОРМАЦИОННЫЕ СВОЙСТВА СВЕРХРАЗВЕТВЛЕННЫХ ПОЛИ-Х-ЛИЗИНОВ1
© 2009 г. А. А. Шпырков, И. И. Тарасенко, Г. А. Панкова, И. Е. Ильина, Э. В. Тарасова, Е. Б. Тарабукина, Г. П. Власов, А. П. Филиппов
Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук 199004 Санкт-Петербург, Большой пр., 31 Поступила в редакцию 27.11.2007 г.
Принята в печать 13.03.2008 г.
Гидродинамические и конформационные свойства сверхразветвленных полиаминокислот на основе лизина изучены методами статического и динамического рассеяния света, скоростной седиментации, поступательной диффузии и вискозиметрии в разбавленных водно-солевых растворах (0.2 М №С1). Проанализировано влияние на молекулярно-массовые характеристики условий синтеза сверхразветвленных полиаминокислот, модификации их концевых групп фрагментами гистидина, а также введения в них между точками ветвления диацилированных остатков лизина, олигомеров и полимеров, состоящих из лизина и глутаминовой кислоты. Гидродинамические свойства исследованных сверхразветвленных полиаминокислот сильно отличаются от поведения как линейного полилизина, так и лизиновых дендримеров, что обусловлено особенностями конформации их макромолекул.
ВВЕДЕНИЕ
Интерес к сверхразветвленным (гиперразветв-ленным) полимерам обусловлен широкими возможностями регулирования их свойств. Наряду с введением функциональных групп эффективным способом управления характеристиками таких высокомолекулярных систем является направленный синтез, позволяющий получать полимеры с заданными степенью ветвления и размерами ветвей при практически фиксированной химической структуре повторяющихся единиц.
Хорошие перспективы практического применения сверхразветвленные полимеры имеют в качестве носителей биологически активных веществ. Как известно, носители ДНК должны быть биосовместимыми, биодеградирующими и неиммуногенными [1]. Указанными свойствами в полной мере обладают активно исследуемые в настоящее время такие регулярные сверхразветвленные полимеры, как лизиновые дендримеры [2—7]. Однако трудоемкость и длительность синтеза и, как результат этого, относительная дороговизна лизиновых дендримеров являются се-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (коды проектов 05-03-33152 и 07-03-00290), Программы фундаментальных исследований Отделения химии и наук о материалах РАН "Создание и изучение макромолекул и макромолекуляр-ных структур новых поколений".
E-mail: afil@mail.macro.ru (Филипов Александр Павлович).
рьезными препятствиями для их широкого применения. В значительной степени указанные ограничения преодолеваются для сверхразветвленных полимеров на основе лизина [8, 9].
Эффективность высокомолекулярного соединения при связывании и компактизации ДНК не в последнюю очередь определяется его молеку-лярно-массовыми и структурно-конформацион-ными характеристиками. В частности, существуют жесткие ограничения по ММ и размерам макромолекул полимера-носителя.
Цель настоящей работы — исследование моле-кулярно-массовых, гидродинамических и кон-формационных свойств сверхразветвленных полиаминокислот на основе лизина. Для этого методами молекулярной гидродинамики и оптики в разбавленных растворах изучены образцы сверх-разветвленных гомополи-Х-лизинов, полученных при различных условиях синтеза, образцы сверхразветвленных гомополи-Х-лизинов, модифицированных по аминогруппам М-концевых остатков лизина гистидином, а также образец сверхразветвленного гетерополи-Х-лизина, в котором вне точек ветвления (диацилированных остатков лизина) располагаются олигомеры или полимеры, построенные из лизина и глутамино-вой кислоты.
Таблица 1. Условия синтеза сверхразветвленных полимеров на основе лизина
Полимер Соотношение Pd : N-карбокси-ангидрид лизина Концентрация N-карбоксиан-гидрид лизина, % Длительность процесса полимеризации, ч Соотношение N-карбоксиангидрид лизина : эфир гистидина Мольное отношение N-концевых аминокислот
массовое мольное* (лизин : гистидин)*
1 1 10 2 4
2 1 10 4 4
3 1 10 6 4
4 1 5 1
5 1 5 24
6 1 5 168
7 168
8 72 1.8 5.6 1 : 34
9 72 1 75.3 1 : 14
Примечание. Соотношение М-карбоксиангидрид лизина : НСООН для образцов 1—6 составляет 1 : 1.5. По данным аминокислотного анализа соотношение лизин : глутаминовая кислота в полимере равно 1 : 1.96. * По данным капиллярного электрофореза.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Синтез сверхразветвленных полиаминокислот
Синтез гиперразветвленного поли-Х-лизина в условиях каталитического удаления №-карбобен-зоксизащиты при использовании восстанавливающей системы муравьиная кислота—палладиевая чернь (табл. 1, полимер 1). К раствору 1.38 г М-карбоксиангидрида №-карбобензокси-Х-ли-зина в 69 мл диоксана, полученного при взаимодействии №-карбобензокси-Х-лизина с трифос-геном по методу [10], в круглодонной трехгорлой колбе, снабженной магнитной мешалкой, прибавляли 140 мг палладия и 2.07 г безводной муравьиной кислоты. Через 4 ч палладиевую чернь отфильтровывали, промывали 10 мл диоксана. Затем диоксан отгоняли на вакуумном испарителе до объема 5 мл и полимер высаживали в петро-лейный эфир. Выпавший полимер отфильтровывали, сушили в эксикаторе. Получили 670 мг полимера.
Снятие защитных групп с полимера. В кругло-донную колбу с магнитной мешалкой помещали 670 мг полимера, растворенного в 6.7 мл трифтор-уксусной кислоты. К раствору прибавляли при перемешивании 0.67 мл тиоанизола и 0.67 мл три-фторметансульфокислоты. Смесь перемешивали 0.5 ч при 0°С, а затем еще 1 ч при комнатной температуре. После окончания перемешивания деблокированный полимер высаживали в 50 мл сухого серного эфира. Выпавший полимер отфильтровывали, вновь растворяли в 10 мл три-фторуксусной кислоты и высаживали в 50 мл серного эфира. Полимер отфильтровывали и сразу подвергали очистке с использованием гель-хроматографии.
Очистка полимера с использованием гель-хроматографии. Полимер растворяли в 2 мл 6%-ной уксусной кислоты и наносили на колонку (60 х х 2.5 см), заполненную Биогелем Р-2. В качестве подвижной фазы использовали 6%-ную уксусную кислоту. Соответствующую фракцию лиофилизо-вали. Получили 71.1 мг полимера.
Аналогично, с учетом определенных изменений методики, синтезировали полимеры 2—6 из табл. 1.
Синтез сверхразветвленных гетерополи-Х-лизи-нов и модифицированных гомополилизинов. Синтез сверхразветвленных гетерополи-Х-лизинов, в которых вне точек "ветвления" (диацилирован-ных остатков лизина) располагаются олигомеры или полимеры, построенные из лизина и глута-миновой кислоты (табл. 1, полимер 7), подробно описан в работе [8], а синтез сверхразветвленных гомополи-Х-лизинов, модифицированных по аминогруппам N-концевых остатков лизина гистидином (полимеры 8 и 9), — в работе [9].
Реактивы. В работе использовали №-карбо-бензокси-Х-лизин, трифосген, палладий на угле, трифторуксусную кислоту, трифторметансульфо-кислоту, тиоанизол, этандитиол производства "Fluka" (Германия). Растворители (получены из Открытого акционерного общества "Вектон", Санкт-Петербург) предварительно очищали и сушили.
Оборудование. При очистке полимеров с помощью гель-хроматографии применяли BioGel P2 (BIORAD Laboratories, США), детекцию проводили на спектрометре 2138 икогё S (Прага). Аминокислотный анализ выполняли на анализа-
Хгр, см 1.890
1.885
1.880
1.875
1/5, (ед. Сведберга)-1
г х 10-6,
Рис. 1. Зависимость координаты седиментаци-онной границы Хгр от времени г для образца 8 при концентрации с = 0.0100 (1), 0.0051 (2), 0.0029 (3) и 0.0011 см3/г (4).
1.0
с х 102, г/см3
Рис. 2. Зависимость обратного коэффициента седиментации 1/5 от концентрации с. Цифры около кривых соответствуют номерам образцов в таблицах.
1
2
3
с
торе ААА Т339 М ("Мюг^есИпа", Прага, Чехословакия).
Определение молекулярно-массовых и гидродинамических характеристик сверхразветвленных поли-Ь-лизинов
ММ синтезированных образцов измеряли двумя абсолютными методами — седиментацион-но-диффузионным анализом и статическим рассеянием света. Эксперименты проводили при 21.0°С. Растворителями служили водно-солевые растворы (0.2 М №С1) с плотностью 1.004 г/см3 и вязкостью 1.0 сП.
Седиментационно-диффузионный анализ. Скоростную седиментацию исследовали на аналитической ультрацентрифуге М0М-3180 (Венгрия) при частоте вращения ротора 45000 об/мин. Се-диментационную границу формировали методом наслаивания растворителя на раствор и регистрировали с помощью оптической системы Филпо-та—Свенссона. Седиментационные диаграммы для всех изученных образцов были унимодальными. Коэффициент седиментации 5 определяли по обычной процедуре [11, 12] по наклону зависимости координаты седиментационной границы Хгр от времени г (рис. 1). Рисунок 2 иллюстрирует изменение 5 с концентрацией раствора с. Экстрапо-
Таблица 2. Гидродинамические и молекулярно-массовые характеристики сверхразветвленных поли-Ь-лизинов
Полимер [п], см3/г 50, ед. Сведберга А Х107, см2/с 3 1 0 X 1 3 1 0 X П, нм п ^Н быстр? нм п ^Н медл? нм , нм ^ ,нм А0 х 1010, эрг/град/моль1/3
1 34 1.6 2.4 42 470 36 5.8 250 9.0 6.1 2.0
2 51 1.8 1.8 92 1730 220 -10 230 12 9.1 2.2
3 59 2.3 3.7 60 960 140 7.7 260 5.9 8.3 4.1
4 11 0.58 5.7 7.2 - - - - 3.8 2.3 1.8
5 22 1.08 6.1 12 - - - - 3.5 3.5 2.9
6 23 0.77 5.7 12 - - - - 3.8 3.5 2.7
7 14 3.0 5.1 26 - - - - 4.2 3.9 2.7
8 24 1.2 7.4 12 110 - - - 2.9 3.6 3.6
9 52 1.4 3.0 29 600 -50 <10 300 7.1 6.2 2.6
2а2 х 102, см2 12
0 5 10
t х 10-4, с
Рис. 3. Зависимость дисперсии а2 диффузионной границы от времени t.
Пуд/с, см3/г 80
60
40
20
0 12 3
с х 102, г/см
Рис. 4. Зависимость приведенной вязкости пуд/с от концентрации c.
3
8
4
ляция £ 1 к c ^ 0 дает значение константы седиментации (табл. 2).
Поступательную диффузию изучали на поляризационном диффузометре [11, 12]. Коэффициент диффузии В раствора концентрации с находили по методу площадей и максимальных ординат. Значения В вычисляли из величины начального наклона зависимо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.