ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 9, с. 991-999
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.062
МОЛЕКУЛЯРНО СЕЛЕКТИВНЫЕ ПОЛЕВЫЕ ТРАНЗИСТОРЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДА
И ЕГО ФОСФАТОВ
© 2007 г. О. М. Петрухин, С. П. Погорелова, А. Б. Харитонов, Е. В. Шипуло
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, факультет естественных наук
125190 Москва, Миусская пл., 9 Поступила в редакцию 30.05.2006 г., после доработки 12.10.2006 г.
Разработаны молекулярно селективные полевые транзисторы для определения окисленных и восстановленных форм никотинамидадениндинуклеотидов (NAD+ и NADH) и их фосфатов [NAD(P)+ и NAD(P)H]. В качестве чувствительных элементов сенсоров использованы сополимеры акриламида и акриламидборной кислоты, импринтироваанные соответствующими нуклеотидами. При вымывании нуклеотидов в полимере сохраняется полость, соответствующая поверхности импринтирован-ного нуклеотида, что и обеспечивает селективность сенсоров. В то же время чувствительность сенсоров со всеми исследованными в растворе нуклеотидами приблизительно одинакова и равна 10-7 М. Свойства сенсоров находят свое объяснение в строении нуклеотидов и составе мембраны.
Ионселективные полевые транзисторы (ИСПТ) [1, 2], впервые предложенные Бергвельдом в 1970 г. [3], до сих пор вызывают повышенный интерес ученых. В настоящее время ИСПТ используют в качестве трансдъюсеров в сенсорах, основанных на различных принципах. В электрохимических сенсорах используют все возможные варианты методов: кондуктометрические, импе-дансометрические, потенциометрические, вольт-амперометрические и амперометрические [4-9].
Одной из основных тем, развиваемых на кафедре аналитической химии РХТУ им. Д.И. Менделеева и в ГЕОХИ им. В.И. Вернадского с 1996 г. [10-13], была разработка химических сенсоров на основе поливинилхлоридных ионочувствитель-ных мембран (ИЧМ) и полевых транзисторов и исследование факторов, влияющих на их функциональные свойства. Энергетическая несовместимость [14] поверхности затвора полевого транзистора (оксида тантала) и гидрофобной поверхности поливинилхлоридной ИЧМ приводила к отслаиванию мембраны при работе ИСПТ. Для улучшения адгезии ИЧМ на поверхность затвора предварительно наносили пленку гребнеобразного полимера на основе полиалкилметакрилатов с длиной алкильной цепочки С10-С22. Проведенные исследования показали способность боковых цепей в макромолекулах гребнеобразных полимеров к внутри- и межмолекулярному упорядочению, что в целом обеспечивает полимерам достаточную адгезионную прочность, определяемую прежде всего химическим строением основной цепи, и хорошие протектирующие свойства за счет упаковки гидрофобных боковых алкильных групп [10]. Такая конструкция была использована
для создания сенсоров на нитрат-ион [11], кальций [12], а также бифункционального сенсора для одновременного определения кальция и лития в растворах [13]. С одной стороны, промежуточный полимер позволил минимизировать проникновение водного раствора к затвору ИСПТ, а с другой, - улучшил адгезию ионочувствительной пВх мембраны к затвору, что в конечном счете привело к значительному увеличению времени жизни сенсоров (до четырех месяцев) и рабочего диапазона рН.
Чувствительность и селективность сенсоров с пластифицированными ионочувствительными мембранами остается недостаточной для решения некоторых аналитических задач, кроме того, иногда остается проблема относительно быстрой деградации аналитических характеристик ИЧМ за счет вымывания активных компонентов мембран (ионофора, пластификатора и липофильных добавок). Приготовление мембран на основе принципа молекулярного импринтинга - один из вариантов повышения качества чувствительных элементов сенсоров и устранения их недостатков. Молекулярно импринтированные полимеры (МИП) -это полимеры, получаемые сополимеризацией мономеров в присутствии импринтируемой молекулы, которая играет роль молекулярного шаблона (темплата), то есть в некотором смысле используется так называемый принцип темплатно-го синтеза, когда прекурсоры целевой молекулы синтеза "организуются" в координационной сфере катиона металла-комплексообразователя, в данном же случае поверхности нуклеотида. Последующее вымывание импринтированной молекулы ведет к образованию в полимере полостей,
комплементарных к ней по размеру, форме и составу функциональных групп; в рамках современного языка к созданию в полимере супрамолеку-лярной полости.
В случае МИП мы имеем не частый случай, когда научное сообщество признает приоритет российских ученых в этой области исследования. Именно Поляков в 30-х гг. опубликовал первую работу по импринтируемым сорбентам на примере кремнезема [15]. Работы Полякова [15-17] послужили началом неорганических импринтиро-ванных сорбентов. В это же время была опубликована работа Полинга по синтезу синтетических рецепторов [18] - начало органических и биохимических МИП. В 70-х гг. появились работы Кабанова с коллегами по "настроенным полимерам" по отношению к ионам переходных металлов [19, 20]. В настоящее время исследование МИП - одно из интенсивно разрабатываемых направлений в аналитической химии [21]. Для биоаналитики МИП привлекательны как метод синтеза искусственных рецепторов, гораздо более устойчивых по сравнению с естественными.
МИП интенсивно исследуют в твердофазной экстракции органических соединений [22, 23] и для извлечения металлов [22]. Синтез полимерных экстрагентов металлов фактически является продолжением работ Кабанова и его коллег [19, 20]. При синтезе экстрагентов металлов для твердофазной экстракции в настоящее время часто используют классические комплексообразующие реагенты, содержащие винильные группы, например для извлечения и разделения лантанидов предложен МИП с функциональной группой эти-лендиаминтетрауксусной кислоты [24], а для извлечения палладия использовали МИП, содержащий функциональные группы диметилглиоксима [25]. Здесь интересно отметить, что, например, МИП для извлечения свинца вполне конкурентоспособен по сравнению с келексом-100 и рядом других ионообменных смол [26]. В качестве чувствительных элементов МИП интенсивно исследуют в химической сенсорике: в оптических, масс-чувствительных, электрохимических сенсорах [26, 27]. В электроанализе в настоящее время популярны специфические МИП - пленки токо-проводящих полимеров с внедренными ионофо-рами [28], которые можно считать двумерными МИП. К МИП можно отнести также самопластифицирующиеся мембраны ИСЭ [29-31].
МИП могут быть приготовлены в виде твердой массы, бусин или слоев на твердой поверхности, в том числе на поверхности кремнезема [32]. Наряду с термином МИП используют термины молекуляр-но импринтированные материалы (МИМ) и полимеры с молекулярными отпечатками (ПМО) [23].
Создание сенсоров для определения нуклеоти-дов NAD(P)+ и NAD(P)H важно для современной
биоаналитической химии, поскольку позволяет in vivo определять ряд ферментов, кофакторами которых они являются. Амперометрическое определение этих веществ в присутствии различных катализаторов [20, 21] характеризуется низкими коэффициентами селективности. Шагом на пути решения проблемы можно считать создание сенсоров на основе ферментного полевого транзистора для селективного определения NAD+ и NAD(P)+ [22].
В данной работе предложен альтернативный метод определения этих нуклеотидов (рис. 1) с помощью МСПТ, в качестве чувствительных элементов которых использован молекулярно им-принтированный акриламидный полимер.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Материалы и методы. Использованы акрила-мид, сшивающий агент - ^№-метиленбисакрила-мид, инициатор радикальной полимеризации ^^№,№-тетраметилэтилендиамин, Ц+)-молоч-ная кислота, у-метакрилоксипропилтриметоксиси-лан, 2-гидроксиэтилметакрилат и 2,2-диметокси-2-фенилацетофенон (Aldrich, США). Нуклеотиды NAD+, NAD(P)+, их восстановленные формы, соответственно, NADH и NAD(P)H, приобретены в Sigma (Швейцария), а персульфат аммония - в фирме Fluka (Швейцария). 3-Акриламидофенил-борная кислота синтезирована в соответствии с методикой [25].
Формирование промежуточного слоя. Для
улучшения адгезии пленки импринтированного полимера с затвором ПТ из оксида алюминия (20 х 700 мкм2, IMT, Neuchatel, Швейцария) затвор предварительно силанизировали у-метакрилокси-пропилтриметоксисиланом [10 об. % в смеси (25 : 1) толуол/вода]. Для этого на затвор ПТ наносили 0.2 мкл раствора силана, после чего ПТ на 4 ч помещали в печь (Euroterm) при температуре 90°C. Затем электроды отмывали толуолом и фосфатным буферным раствором (0.1 M, pH 7.3) и сушили на воздухе в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем на силанизированную поверхность ПТ наносили каплю композиционной смеси мономера 2-гидроксиэтилметакрилата и инициатора полимеризации 2,2-диметокси-2-фенилаце-тофенона (4 об. %). Поверхность затвора облучали УФ лампой в течение 5 мин. Эта процедура позволяет ковалентно пришить слой поли-2-гид-роксиэтилметакрилата к силанизированной поверхности затвора [13].
Формирование импринтированных мембран.
Для формирования мембраны непосредственно на поверхности ПТ или на поверхности после ее сила-низации полимерную смесь, содержащую функциональные мономеры акриламид (1.82 М) и 3-ак-риламидофенилборную кислоту (0.1 М), сшиваю-
н н онно о
о
о
нн ^ о
КН2
нн онно о
-о-Р-о-Р-о—
I I
он он
н
н
он он
о
КЛБ+
о
нн
N
-о-р-о-р-о—
I I
он он
н
н
он он
о
NH2
КЛБИ
N
N
нн онно о
н
N+
оо
н
—о—I I I
он он
н
о
NH2
н
онно о
н
КЛБ(Р)+
оо
нн
N
•—о-Р-о-Р-о—I I I
он он
нон
н
н
о
NH2
КЛБ(Р)И
NH2
N
он о
I
о-Р=о
I
он
14 Г
кн2
N
N
он о I
о-Р=о
I
он
Рис. 1. Структуры темплатов и анализируемых кофакторов.
щий агент ^№-метиленбисакриламид (0.04 М) и соответствующие темплаты, растворяли в 0.5 мл фосфатного буферного раствора (0.1 М, рИ 7.3). Смесь нагревали до полного растворения всех компонентов. Инициаторы полимеризации персульфат аммония (0.22 М, 0.05 мл) и тетраметилэтилендиамин (10 об. %, 0.12 мл) добавляли в полимерную смесь непосредственно перед нанесением 0.1 мкл смеси на предварительно обработанную поверхность элек
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.