МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 1, с. 138-148
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.21
МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И ПАТТЕРНЫ ЭКСПРЕССИИ ДВУХ ГЕНОВ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ а ОБЫКНОВЕННОГО КАРАСЯ (Carassius carassius)
© 2015 г. R. Athanas, L. Xue*, M. Aynealem
College of Marine Sciences, Laboratory of Molecular Biology, Ningbo University, Ningbo, Zhejiang, 315211, P.R. China
Поступила в редакцию 14.04.2014 г. Принята к печати 10.06.2014 г.
Фактор некроза опухолей (ЮТ) — мощный цитокин, вырабатываемый при воспалении. В представленной работе клонированы и секвенированы два гена TNF-a — TNFa-1 и TNFa-2 обыкновенного карася Carassius carassius. кДНК TNFa-1 состоит из 720 п.н. и содержит открытую рамку считывания из 699 п.н., кодирующую белок из 232 аминокислотных остатков, а кДНК TNFa-2 длиной 793 п.н. содержит открытую рамку считывания из 687 п.н., которая кодирует белок из 228 аминокислотных остатков. Гены обоих белков состоят из четырех экзонов и трех интронов, сходных с экзонами и интронами других известных генов TNF-a. Аминокислотные последовательности XNFa-1 и XNFa-2 обыкновенного карася наиболее сходны с XNFa обыкновенного карпа и золотой рыбки, наименее — с INF-a камбалы и человека. Филогенетический анализ группирует TNFa-1 и TNFa-2 обыкновенного карася с TNF других карповых, наиболее близкими из которых оказываются TNFa-1 и TNFa-2 золотой рыбки и обыкновенного карпа. С использованием ПЦР в реальном времени показано, что TNFa-1 и TNFa-2 конститутивно экспрессируются на высоком уровне в семи изученных тканях обыкновенного карася. Показано, что уровень мРНК TNFa-1 в печени и почках значительно выше уровня TNFa-2, тогда как в мышцах наблюдается обратная картина. Уровень экспрессии обоих генов во всех тканях возрастал при заражении рыб Aeromonas hydrophila BSK-10. Через 6 ч после заражения экспрессия TNFa-1 значительно повышалась в мышцах, коже и печени, а TNFa-2 — в мышцах и жабрах. Уровень экспрессии гена TNFa-1 был при этом намного выше, чем TNFa-2. Через 12 ч экспрессия начинает снижаться и к 24 ч становится существенно ниже. Эти результаты означают, что мРНК TNFa-1 и TNFa-2 по-разному распределены в тканях, а их белковые продукты участвуют в иммунном ответе на бактериальные инфекции.
Ключевые слова: Aeromonas hydrophila BSK-10, обыкновенный карась Carassius carassius, мРНК, паттерн экспрессии, ПЦР в реальном времени, фактор некроза опухолей a.
MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION PATTERNS OF TWO TUMOR NECROSIS FACTOR ALPHA GENES IN CRUCIAN CARP (Carassius carassius ), by R. Athanas, L. Xue*, M. Aynealem (College of Marine Sciences, Laboratory of Molecular Biology, Ningbo University, Ningbo, Zhejiang, 315211, P. R. China; *e-mail: xueliangyi@nbu.edu.cn). Tumor necrosis factor (TNF) is a potent inflammatory cytokine produced during inflammation. In this study, two Crucian carp TNF-a genes, TNFa-1 and TNFa-2 were cloned and sequenced. The TNFa-1 was 720 bp and consisted of a 699 bp opening reading frame encoding 232 amino acids and TNFa-2 was 793 bp and contained an open reading frame of687 bp which encoded 228 amino acids. The genomic structure of both genes consists of 4 exons and 3 introns similar to other known TNF-a genes. The amino acid sequence of crucian carp TNFa-1 and TNFa-2 shared the highest identity with common carp, goldfish and the lowest with flounder and human. The phylogenetic analysis grouped crucian carp TNFa-1 and TNFa-2 with other cypriniformes, which are more closely related to the goldfish and common carp TNFa-1 and TNFa-2. Real time PCR analysis showed a constitutive expression of crucian carp TNFa-1 and TNFa-2 in all seven tissues examined. The TNFa-1 mRNA was expressed significantly higher in the liver and kidney than those of TNFa-2 while TNFa-2 was expressed significantly higher in the muscle than that of TNFa-1. Aeromonas hydrophila BSK-10 strain upregulated the expression level of TNFa-1 and TNFa-2 in all tissues tested. At 6 h, the expression level of TNFa-1 increased significantly higher in muscle, skin and liver, while the expression level of TNFa-2 increased significantly higher in muscle and gill. TNFa-1 expressed much stronger than TNFa-2. At 12 h the expression level started declining and was more reduced at 24h. These results imply that both TNFa-1 and TNFa-2 mRNA are distributed differently in tissues and are implicated in the immune response to bacterial infection.
Keywords: Aeromonas hydrophila BSK-10, Crucian carp Carassius carassius, mRNA, expression patterns, Real Time PCR, tumor necrosis factor a.
DOI: 10.7868/S0026898415010024
* Эл. почта: xueliangyi@nbu.edu.cn
TNF-a — главный представитель суперсемейства TNF-лигандов, играющий критически важную роль в иммунном ответе и воспалительных процессах [1]. TNF-a известен как плейотроп-ный и мощный провоспалительный цитокин, который вырабатывается клетками нескольких типов, в том числе макрофагами, моноцитами, по-лиморфноядерными лейкоцитами, тучными и гладкомышечными клетками [2] в ответ на воспаление, инфицирование и другие физиологические вызовы [3]. TNF-a активирует продукцию других воспалительных цитокинов [4] и элиминирует бактериальные и вирусные патогены, усиливая многие клеточные процессы, включая фагоцитоз, хемотаксис, продукцию активных форм кислорода и азота [4, 5]. У млекопитающих описаны две формы TNF (TNF-a и TNF-ß), тогда как у рыб обнаружена только одна, сходная по структуре и организации с TNF-a млекопитающих [7]. Первый костистой рыбой, у которой идентифицировали ген TNF-a, была японская камбала (Paralychthys olivaceus) [8]. Затем этот ген клонировали и секвенировали у многих видов рыб [9— 24]. Гены TNF-a состоят из трех экзонов и четырех интронов, они обладают сходством с TNF-a млекопитающих [25]. В геноме японской камбалы, как и в геноме млекопитающих, ген TNF-a представлен единственной копией [8]. Недавно у некоторых рыб идентифицировали по нескольку изоформ TNF-a — четыре у обыкновенного карпа [13—15], по две у радужной форели, золотой рыбки и голубого тунца [10, 23, 24, 26, 27]. Выявлены различия в характере экспрессии изоформ TNF-a, так мРНК TNFa-2 экспрессируется во всех тканях золотой рыбки более активно, чем TNFa-1 [23], тогда как у голубого тунца уровень экспрессии мРНК TNFa-1 во всех проанализированных тканях был выше, чем TNFa-2 [24]. Экспрессия TNF-a активируется у разных видов рыб после стимуляции бактериями [15, 18] и вирусами [19].
Обыкновенный карась — хозяйственно важный вид пресноводных рыб, культивируемый в Европе, Северо-Восточных регионах таких стран, как Япония, Китай и Корея [28]. Главную проблему при культивировании обыкновенного карася представляют вспышки бактериальных инфекций, которые приводят к сокращению рыбного стада и экономическим потерям. Грамотрица-тельная бактерия Aeromonas hydrophila, вызывающая септицемию у различных пресноводных рыб, например у карпов и сомов, а эпизодически и у морских видов, таких как лососевые, отвечает за высокую заболеваемость и гибель рыб в условиях пресноводной и морской аквакультуры [29, 30].
С целью выяснения особенностей экспрессии гена TNF-a обыкновенного карася в ответ на заражение A. hydrophila BSK-10 клонировали гены двух изоформ TNF-a и проанализировали характер их экспрессии в разных тканях. Изучение экс-
прессии TNF-a в различных тканях и его воздействия на патоген важно для понимания выраженности раннего иммунного ответа.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Рыбы. Обыкновенных карасей (Carassius caras-sius, 300 г) приобретали на рыбном рынке в городе Нингбо (китайская провинция Чжэцзян). Рыб содержали в 100 л емкостях, снабжаемых аэрируемой пресной водой, кормили коммерческим гранулированным кормом 2 раза в день. Температуру воды поддерживали на уровне 20—25°C. Рыб акклиматизировали к лабораторным условиям не менее 7 дней, а затем заражали бактериальным патогеном.
Клонирование и секвенирование генов TNF-a обыкновенного карася. Суммарную РНК выделяли из почек обыкновенного карася, используя набор RNAiso Plus ("TAKARA", Япония), согласно инструкции производителя. Первую цепь кДНК синтезировали на суммарной РНК с использованием набора PrimeScript RT Reagent Kit ("TAKARA") в соответствии с инструкциями фирмы. кДНК использовали для ПЦР-амплификации с вырожденными праймерами: TIF/T1R для TNFa-1 и TNF2F/TNF2R для TNFa-2 (таблица), подобранными к консервативным участкам TNFa-1 (AJ3111800) и TNFA-2 (AJ311801) обыкновенного карася, TNFa-1 (EU069817) и TNFa-2 (EU069818) золотой рыбки и TNF-a (HQ696609) белого амура с использованием программ Vector NTI 7 и primer 5. ПЦР проводили в следующих условиях: 1 цикл — 94°C, 2 мин; 30 циклов - 94°C, 30 с; 50-60°C (температура отжига, специфичная для пар прай-меров), 30 с; 72°C, 30 с; 1 цикл - 72°C, 10 мин. Продукты ПЦР очищали из агарозного геля с использованием набора DNA purification kit ("SANGON", КНР), а затем лигировали в вектор pMD19-T ("TAKARA") и трансформировали компетентные клетки Escherichia coli TG1. Положительные колонии отбирали и секвенировали ("Invitrogen", КНР).
Получили частичные последовательности кДНК (или мРНК) TNFa-1 размером 267 п.н. и TNFa-2 — 771 п.н., включающие стартовые кодо-ны. Анализ этих последовательностей с помощью программы BLAST выявил их сильную гомологию с другими известными последовательностями TNF, что было использовано для конструирования новых праймеров (таблица). Прямой прай-мер для TNFa-1 (T1FF) подобрали по частичной установленной последовательности мРНК, а обратный праймер (T1RR) — на основе консервативных областей других известных TNFa-1, которые включают стоп-кодон. Обратный праймер для TNFa-2 (TNFa2R) подобрали на основе известных TNFa-2 таким образом, чтобы получить полную открытую рамку считывания (ORF).
Геномную ДНК выделяли из печени обыкновенного карася с использованием фенол-хлороформного метода [31] с реагентами фирмы "INVITROGEN". ПЦР на суммарной геномной ДНК проводили с праймерами TIF и TIRR для TNFa-1, TNF2F и TNFa2Rдля TNFa-2 (таблица). Использовали следующие условия ПЦР: 1 цикл — 94°C, 3 мин; 30 циклов - 94°C, 30
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.