МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 5, с. 742-751
ГЕНОМИКА. ^^^^^^^^^^^^ ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.21
МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ, СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ГЛИКОПРОТЕИНА ZP3 ZONA PELLUCIDA КИТАЙСКОГО ЦОКОРА Myospalax fontanierii#
© 2014 г. D.-D. Sui, J.-L. Wu, H. Zhang, H. Li, Z.-M. Zhou, D.-H. Zhang, C.-X. Han*
College of Forestry, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100, P.R. China Поступила в редакцию 17.01.2014 г. Принята к печати 01.04.2014 г.
Белок zona pellucida 3 (ZP3) играет ключевую роль в иммунности репродуктивной системы. Используя быструю амплификацию концов кДНК с последующей полимеразной цепной реакцией (RACE-PCR) получили полную кДНК, кодирующую ZP3 китайского цокора Myospalax fontanierii. Эта кДНК содержит открытую рамку считывания из 1269 н., кодирующую полипептид из 422 аминокислотных остатков, высокогомологичный ZP3 хомячка (78%), мыши (76%) и крысы (74%). XhoI-SacI-фрагмент кДНК ZP3 размером 1158 п.н., не кодирующий сигнальный пептид и домен, сходный с трансмембранным, клонировали под контроль промотора фага Т7-lac-оперaторa в вектор рЕТ-28а(+). Рекомбинантный белок рЕТ-ZokoгZP3 (r-ZP3) экспрессировали в штамме BL21(DE3) Escherichia coli в виде слитого с полиги-стидином белка. Оптимум экспрессии наблюдали через 2 ч после индукции 1 мМ IPTG при 28°C. Очищенный белок анализировали с помощью вестерн-блотинга.
Ключевые слова: китайский цокор, рекомбинантный ZP3, структурный анализ, zona pellucida.
MOLECULAR CLONING, STRUCTURAL ANALYSIS, AND EXPRESSION OF ZONA PELLUCIDA GLYCOPROTEIN ZP3 GENE FROM CHINESE ZOKOR, Myospalax fontanierii*, by D.-D. Sui, J.-L. Wu, H. Zhang, H. Li, Z.-M. Zhou, D.-H. Zhang, C.-X. Han* (College of Forestry, Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100, P.R. China; *e-mail: sendakingcat@nmsuaf.edu.cn). The zona pellucida 3 (ZP3) plays a crucial role in reproductive immunology. We obtained a full-length cDNA encoding Chinese Zokor zp3, using rapid amplification of cDNA ends-polymerase chain reaction (RACE-PCR). The cDNA contains an open reading frame of 1269 nucleotides encoding a polypeptide of 422 amino acid residues. The amino acid sequence has a high degree of homology with hamster (78%), mouse (76%), and rat (74%). XhoI and SacI sites restricted 1158 bp fragment of zokor ZP3 cDNA, excluding the signal sequence and transmembrane-like domain was cloned under the phage T7 promoter-lac operator control in the pET-28a(+) vector. Recombinant pET-zokorZP3 (r-ZP3) was expressed as a poly-histidine fusion protein in E. coli strain BL21 (DE3). Optimum expression of r-ZP3 was observed at 28°C, 1 mM IPTG and 2 h of inducing. The purified protein was tested by Western blot.
Keywords: Chinese zokor, expression, recombinant ZP3, structural analysis, zona pellucida.
Б01: 10.7868/80026898414050140
Китайский цокор (Ыуозра1ах /оШатвгп) — эндемичный для Китая вид грызунов семейства 8ра1ае1ёае — считается основным вредителем Лессового плато Северо-Западного Китая. Этот приспособленный к обитанию в предгорных областях вид широко распространен в заповедниках, альпийских лугах и степях. Китайские цокоры активны круглый год, они устраивают в своих норах кладовые для хранения пищевых запасов, в десятки раз превышающих потребности. Согласно ста-
# Текст представлен авторами на английском языке.
* Эл. почта: sendakingeat@nwsuaf.edu.en
тистическим данным Национального центра экстенсивных сельскохозяйственных технологий (2012), средняя численность грызунов достигает 12.6 особей на 1 га. Это означает, что на Лессовом плато площадью почти 40 млн. га обитает более 400 млн. цокоров, причиняющих колоссальный ущерб сельскому и лесному хозяйству.
В Китае первая публикация о цокорах появилась в 1962 г. [1]. В этой работе изучали распространение и экологию цокоров на Лессовом пла-
то, в дальнейшем начали исследовать поведение этих животных. Цокоры обитают в предгорных областях, их достаточно сложно отлавливать, поэтому большая часть работ посвящена морфологии, биологическим особенностям и способам контроля численности этого вида. Однако до сих пор не существует удобного и эффективного метода контроля численности этих грызунов. Отсутствуют также данные о молекулярных основах репродукции китайского цокора.
Zona pellucida (ZP) — внеклеточный гликопро-теиновый слой, окружающий ооцит млекопитающих, который выполняет несколько уникальных функций в процессе оплодотворения и раннего эмбрионального развития [2]. Известны три основных белковых формы ZP — ZP1, ZP2 и ZP3 [3]. ZP3 — это рецептор спермиев и индуктор акросом-ной реакции, в результате которой происходит высвобождение литических ферментов, предположительно важных для проникновения спермиев через ZP [4, 5]. Свойствам ZP3 как иммунного агента посвящены многочисленные работы. Показано, что иммунизация против антигенов ZP приводит к нарушению фертильности самок коалы [6]. Активная иммунизация достигается при применении гомологов ZP3 в качестве иммуногена [7]. Считается, что такой подход можно рассматривать как эффективный и гуманный метод контроля численности популяции китайского цокора.
Насколько нам известно, мы предлагаем первый метод иммунорегуляции численности китайского цокора. С использованием метода быстрой амплификации концов кДНК с последующей по-лимеразной цепной реакцией (RACE-PCR) нами получена полная кДНК, кодирующая ZP3 китайского цокора. Анализ структуры выявил некоторые отличия ZP3 китайского цокора от ZP3 хомячка и человека. Установлено, что начальная и концевая области гена имеют явные отличия от соответствующих последовательностей других видов Cricetidae, что также подтверждает несоответствие морфологической и молекулярной классификации. Мы полагаем, что китайского цокора скорее можно отнести к Spalacidae, чем к Cricetidae.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Животные. Самок цокора отлавливали на горе Луо Лессового плато, провинция Шаанхи, в Северо-Западном Китае. Содержание животных и проведение экспериментальных процедур соответствовали требованиями Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных [8]. Шесть подходящих самок были отловлены местными фермерами с использованием принятых методов обращения с цокорами. Животных умерщвляли через 48 ч после обследования, помещая их в среду CO2. Яичники извлекали и хранили до использования при —80°C.
Очистка РНК из яичников цокора и получение консервативной последовательности. Суммарную РНК выделяли из 50 мг замороженной ткани яичников, используя набор RNeasy ("Sangon", КНР), согласно инструкции производителя. Количество РНК определяли спектрофотометрически на детекторе нуклеиновых кислот ("MaestroGen", КНР). Для получения полноразмерной кДНК ZP3 использовали праймеры, представленные в таблице. Сначала сконструировали праймеры на консервативные последовательности, исходя из последовательностей ДНК крысы, хомячка, Microtus brandti и пеструшки (GenBank Acc. no. D78482, M63629, AF304487 и AF515621). Для синтеза первой цепи кДНК с праймером олиго^Т) (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, Thermo) использовали 2 мкл раствора суммарной РНК яичников цокора в общем объеме смеси 20 мкл. PCR проводили в объеме 50 мкл, содержащем 2 мкл кДНК-мише-ни, 2 мкл каждого консервативного праймера (C1 и C2), 25 мкл 2х Es Taq MasterMix ("Cwbio", КНР) и 19 мкл бидистиллированной Н20. После начальной стадии денатурации в течение 3 мин при 94°C проводили 30 циклов PCR: 94°C, 0.5 мин; 60°C, 0.5 мин и 72°C, 1 мин. Последняя стадия элонгации — 10 мин при 72°C. Продукты PCR анализировали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Реакционную смесь PCR (5 мкл) разделяли в течение 25 мин при 120 В и визуализировали в ультрафиолете, используя краситель нетоксичного типа 4S Green для нуклеиновых кислот ("Sangon", КНР). Нужную полосу вырезали, ДНК очищали с помощью набора Gel Extraction Kit ("BioSci", КНР), руководствуясь протоколом фирмы. После этого очищенные продукты отправляли на секвенирование в фирму "Sangon".
Быстрая амплификация концов кДНК и амплификация полной открытой рамки считывания. Для
получения полноразмерной кДНК ZP3 провели быструю амплификацию 5'- и 3'-концов кДНК (RACE) с использованием набора SMART RACE cDNA Amplification Kit ("Takara", Япония) в соответствии с инструкцией фирмы. Амплификацию 3'-концевой области выполняли с использованием внутреннего, специфичного для кДНК цокора, праймера GSP2 и вложенного универсального праймера NUP после первичной амплификации с внешними, специфичными для кДНК цоко-ра, праймерами GSP1 и UPM. Сходным образом 5'RACE-PCR провели со специфичными для кДНК цокора праймерами: внешним GSP4 и внутренним GSP3. И 3'-, и 5'-RACE проводили методом "touchdown" PCR при температуре отжига 68°C [9, 10]. Продукты очищали и секвенировали, как описано выше. Исходя из результатов 5'- и 3'-RACE, сконструировали праймеры F1 и R1 для получения полной открытой рамки считывания ZP3 китайского цокора.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая ZP3 цокора, помещена в GenBank (Асс. по. KF360058). Гомологию нуклеотидных последовательностей анализировали с помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast/). Прямое сравнение последовательностей проводили, используя программы MEGA5 и BioXM.
Аминокислотные последовательности анализировали с помощью пакета программ: "Scan-protsite" для сканирования в белках мотивов из коллекции PROSITE и "SingnalP" с целью предсказания сигнальных последовательностей и сайтов расщепления; "TMHMM" для предсказания трансмембранных доменов и сайтов расщепления; "NetOGlyc" и "NetNglyc" для предсказания потенциальных сайтов N- и O-гликозилирования; "SOPMA" для предсказания вторичной структуры белков.
Регистрационные номера (Асс.по.) генов ZP3, цитируемых в данной работе: Papio anubis (XM_003895843.1); Macaca mulatta (XM_002803236.1); Xenopus (NM_001113999.1); Pan troglodytes (XM_528035.3); Nomascus leucogenys
(XM_003276618.1); Mus musculus (NM_011776.1); Loxodonta africana (XM_003416567.1); Homo sapiens (NM_001110354.1); Gallus gallus (NM_204389.2); Felis catus (NM_001009330.1); Danio rerio (NM_1313
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.