ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 8, с. 1013-1025
ОБЗОРНЫЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СТАТЬИ
УДК 575.224.4:582.28
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИНСЕРЦИОННОГО МУТАГЕНЕЗА У ДРОЖЖЕЙ И МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
© 2007 г. К. В. Дмитрук1, А. А. Сибирный1' 2
1 Институт биологии клетки Национальной академии наук Украины, Львов 79005, Украина;
e-mail: sibirny@cellbiol.lviv.ua 2 Жешовский университет, биолого-сельскохозяйственный факультет, Жешов 35-601, Польша
Поступила в редакцию 24.03.2006 г.
Случайный инсерционный мутагенез является эффективным методом при исследовании молекулярных механизмов многих генетически обусловленных процессов. Улучшенная разновидность этого метода -REMI-мутагенез (Restriction Enzyme Mediated Integration mutagenesis). Особенность данного метода заключается в том, что в клетку реципиента вводят инсерционную кассету вместе с эндонуклеазой рестрикции. В результате инсерция REMI-кассеты происходит в геном в сайты узнавания рестриктазы. Использование рестриктаз приводит к повышению частоты трансформации, а также обеспечивает инсер-цию кассеты практически в любом локусе. Мутация метится инсерционной кассетой, которая может быть идентифицирована посредством выделения REMI-кассеты вместе с фланкирующими участками геномной ДНК. В обзоре описаны общие требования к REMI-мутагенезу. Обобщены механизмы REMI-мутагенеза на примере дрожжей Saccharomyces сerevisiae. Особое внимание уделено разработке и использованию REMI-мутагенеза для других видов низших эукариот (дрожжей и плесневых грибов). Указаны недостатки, а также рассмотрены перспективы развития данного метода.
Метод инсерционного мутагенеза основывается на получении мутаций путем интеграции нук-леотидной последовательности (далее - инсерционной кассеты) в геном организма-реципиента, что влечет за собой изменение или блокирование экспрессии данного гена. Изменение активности гена может быть направленным или случайным. Разновидностью инсерционного мутагенеза является транспозоновый мутагенез, который позволяет манипулировать генами, используя механизм сайт-специфичной интеграции. При транс-позоновом мутагенезе инсерционная кассета, окруженная концевыми последовательностями мобильных элементов, интегрирует в разные сайты генома. Этот метод широко используется для генерации мутаций, а также для функционального анализа геномов [1]. Однако, несмотря на простоту и удобство, ему присущи некоторые недостатки. Одним из важнейших недостатков транс-позонового мутагенеза является неслучайное встраивание инсерционной кассеты. Это происходит потому, что его мишени находятся преимущественно за пределами открытых рамок считывания (ОРС), тогда как в ряде задач необходимо получать инсерции, происходящие в любой точке генома с одинаковой вероятностью. Поэтому на основе инсерционного мутагенеза был разработан другой метод, базирующийся на механизме негомологичной рекомбинации, - REMI-мутагенез (Restriction Enzyme Mediated Integration mutagenesis). Его особенность заключается в том, что в клетку реципиента вводят инсерционную
кассету вместе с рестрикционной эндонуклеазой. В результате инсерция REMI-кассеты происходит в геном в сайты узнавания рестриктазы, которой она предварительно была обработана. Использование рестриктаз, узнающих короткие четырех-нуклеотидные последовательности, обеспечивает инсерцию кассеты практически в любом локусе. Интегрированная REMI-кассета может быть изолирована вместе с фланкирующими участками геномной ДНК, если содержит репликатор -бактериальный "ориджин" начала репликации (ori) и селективный маркер для отбора трансформантов в клетках Escherichia coli. Таким образом, мутировавший ген метится инсерционной кассетой и может быть легко изолирован известными методами [2].
В целом REMI-мутагенез является одним из наиболее перспективных методов мутагенеза с последующей идентификацией и клонированием соответствующих генов. Цель данного обзора -рассмотрение механизма REMI-мутагенеза, его недостатков и перспектив для использования у низших эукариот (дрожжей и плесневых грибов).
общие требования к методу remi-мутагенеза
В настоящий момент для генерации мутаций и функционального анализа дрожжевых геномов используется инсерционный транспозоновый мутагенез [1, 3], который происходит при интеграции модифицированных Iy-элементов [4]. Одна-
ко, как сказано выше, мишени для Гу-интеграций представлены в геноме неслучайно и находятся преимущественно за пределами ОРС, поблизости генов тРНК или длинных концевых повторов мобильных элементов, которые присутствовали в том или ином локусе ранее. Вероятно, такая локализация "горячих" точек инсерций обеспечивает Ту относительно нейтральное существование в геноме реципиента [5, 6]. При использовании REMI-мутагенеза 50% инсерционных событий у Saccharomyces cerevisiae происходило в последовательности известных или гипотетических ОРС [7]. Преимущества REMI-мутагенеза у дрожжей несомненны, принимая во внимание, что около 70% последовательностей дрожжевых геномов приходятся на известные или гипотетические ОРС [8].
Особенность метода REMI-мутагенеза заключается в том, что линеаризованная инсерционная кассета интегрирует в геном реципиента по сайтам эндонуклеазы рестрикции, которую вносят вместе с кассетой в клетку-реципиент. Селекция REMI-трансформантов ведется по маркеру, находящемуся в составе кассеты. Преимуществами обладают доминантные маркеры, так как они не требуют предварительной селекции реципиентно-го штамма, в противоположность использованию ауксотрофных маркеров. Доминантные селекционные маркеры, как правило, гетерологичного происхождения, а значит их последовательности не проявляют достаточной для гомологичной рекомбинации гомологии с геномом реципиента. Такие селекционные маркеры имеют преимущества в системах с высокой частотой гомологичной рекомбинации [9-11]. Необходимыми компонентами инсерционной кассеты являются элементы, обеспечивающие ее репликативность и селекцию в E. coli.
Вектор для REMI-мутагенеза должен содержать уникальный сайт рестрикции для линеаризации инсерционной кассеты, что является неотъемлемым требованием для обеспечения инсерционных событий. Показано, что интеграция не наблюдалась при трансформации кольцевыми плазмидами без рестриктазы или в ее присутствии, если отсутствуют сайты рестрикции на соответствующем векторе. Трансформация кольцевыми плазмидами с добавлением рестриктазы, сайт узнавания которой находится в векторе, обеспечивает низкую частоту интеграции, вероятно, за счет расщепления плазмиды при трансформации [7]. Известно, что эндонуклеазы рестрикции проявляют способность к слабому неспецифическому связыванию ДНК [12]. Рестриктазы способны связываться с ДНК при трансформации и усиливать поглощение ДНК, что приводит к повышению количества интеграционных событий. Эндонуклеазная активность модифицированной рестриктазы BamHI-Е77К практически отсутствует, однако такой бе-
лок эффективно связывается с сайтом BamHI. Несмотря на это, добавление BamHI-E77K на частоту интеграции не влияло. Таким образом, для обеспечения REMI необходима именно эндонуклеазная активность.
Для достижения максимальной частоты трансформации и минимального цитотоксического эффекта необходимо оптимизировать количество рестриктазы. Как правило, чем выше концентрация фермента, тем выше частота инсерционных событий.
Вслед за отбором мутантов с соответствующими фенотипическими характеристиками определяют количество копий и природу инсерционных событий при помощи Саузерн-гибридизации с использованием REMI-вектора в качестве зонда. Интегрированную плазмиду изолируют из хромосомной ДНК вместе с фланкирующими последовательностями, замыкают в кольцевую форму с помощью ДНК-лигазы и трансформируют в E. coli. Поврежденный ген идентифицируют с помощью секвенирования, используя праймеры, комплементарные последовательностям REMI-вектора [13]. Разработан также метод идентификации гена с использованием ПЦР. После обработки хромосомной ДНК соответствующей ре-стриктазой к концам образованных фрагментов с помощью ДНК-лигазы присоединяют синтетические линкеры. Используя праймеры, гомологичные REMI-вектору, с одной стороны, и линкерам, с другой, с помощью ПЦР нарабатывают продукт, который идентифицируют секвенировани-ем [14].
Необходимы доказательства в пользу того, что соответствующий фенотип обусловлен интеграцией вектора в определенный сайт, поскольку мутации могут возникать за счет нуклеазных примесей в литических ферментах, которые используются для формирования протопластов, или за счет расщепления ДНК рестриктазами с дальнейшей репарацией при отсутствии REMI-кассеты. В зависимости от исследуемой системы используют различные подходы:
а. Невозможность проведения сегрегации фенотипа и селекционного маркера REMI-плазмиды при скрещивании со штаммом дикого типа служит веским доказательством проявления определенного фенотипа вследствие инсерции кассеты.
б. Изолированную вместе с фланкирующими последовательностями инсерционную кассету используют для интеграции в геном штамма дрожжей дикого типа с помощью гомологичной рекомбинации. Полученный штамм сопоставляют с исходным REMI-мутантом, используя Саузерн-гибридизацию и сравнение фенотипических признаков.
в. Тест включает в себя комплементацию мутаций REMI-интегрантов плазмидами или косми-
дами, которые содержат соответствующие локу-сы штамма дикого типа [13]. Чаще всего используется комплементационный тест, так как не требует способности штаммов к половой гибридизации. Этот тест также является наиболее быстрым методом и может быть использован в организмах с неэффективной системой гомологичной рекомбинации.
механизм remi-мутагенеза у дрожжей и грибов
Первоначально метод REMI-мутагенеза был разработан для S. cerevisiae. Позже он был успешно использован у Dictyostelium discoideum. Именно в этих организмах были детально исследованы механизмы интеграции [2, 15]. Было показано, что при трансформации клеток S. cerevisiae добавление рестриктаз BamHI, BgllI или KpnI к плазмидам, линеаризованным этими же ферментами, значительно повышало эффективность интеграции (в 5.5, 4.4 и 5.0 раз соответственно) по ср
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.