МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 5, с. 825-833
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА =
УДК 575.852:577.152.321:582.282.232
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ a-ГАЛАКТОЗИДАЗНЫХ ГЕНОВ MEL ДРОЖЖЕЙ Saeeharomyoes sensu stricto
© 2003 г. Е. С. Наумова, И. В. Коршунова, Г. И. Наумов
Федеральное государственное унитарное предприятие "ГосНИИгенетика", Москва, 113545
Поступила в редакцию 23.04.2003 г.
Для изучения молекулярной эволюции дрожжей Saccharomyces sensu stricto на основе анализа родового суперсемейства а-галактозидазных генов MEL были клонированы и секвенированы два новых гена дрожжей S. bayanus var. bayanus и S. pastorianus. Обнаружена высокая степень сходства нукле-отидных последовательностей генов MEL дрожжей S. bayanus var. bayanus (MELb), S. pastorianus (MELpt), S. bayanus var. uvarum (MELu) и S. carlsbergensis (MELx) (94.1-99.3%), сопоставимая с внутривидовым уровнем гомологии генов MEL1-MEL11 дрожжей S. cerevisiae (94.8-100%). Гомология генов MEL видов-двойников S. cerevisiae (MEL1), S. bayanus (MELb), S. paradoxus (MELp) и S. mikatae (MELj) составляет 76.2-81.7%. Эти данные свидетельствуют о видоспецифичности генов MEL1, MELb, MELp и MELj и указывают на происхождение а-галактозидазного гена гибридных дрожжей S. pastorianus (S. carlsbergensis) от S. bayanus, а не S. cerevisiae.
Ключевые слова: Saccharomyces sensu stricto, S. bayanus var. uvarum, S. pastorianus, микроэволюция, а-галактозидазы, секвенирование, гены MEL.
Способность дрожжей Saccharomyces гидроли-зовать и утилизировать а-галактозиды (мелибио-зу, раффинозу, стахиозу) определяется а-галак-тозидазными полимерными генами MEL. Семейство этих генов представляет собой уникальную модель для изучения микроэволюции ферментативных признаков. Культурные дрожжи S. cerevisiae и их пять видов-двойников - S. bayanus, S. ca-riocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae и S. paradoxus -относятся к комплексу видов Saccharomyces sensu stricto [1-3]. Большинство штаммов дрожжей S. cerevisiae не сбраживают мелибиозу и даже не содержат молчащей последовательности MEL [4, 5], в том числе и генетические линии, использованные в международном проекте по секвенирова-нию всего генома дрожжей S. cerevisiae [6]. Известны специфические популяции дрожжей S. cerevisiae, обитающие в желудочно-кишечном тракте млекопитающих и отходах производства оливкового масла, в которых происходит накопление полимерных генов MEL [7, 8]. Идентифицировано одиннадцать полимерных генов - MEL1-MEL11, расположенных в теломерных районах различных хромосом [4, 9-12]. Ген MEL1 имеется в некоторых генетических линиях и штаммах клинического происхождения [13], а ген MEL2 обнаружен у штамма, выделенного с ягод винограда [9]. Нук-леотидные последовательности отдельных представителей этого семейства высоко гомологичны (96-100%) [13, 14].
* Эл. почта: gnaumov@yahoo.com
Штаммы S. paradoxus, S. kudriavzevii и S. cario-canus также не способны сбраживать мелибиозу, кроме очень редких изолятов Mel+ дрожжей S. paradoxus в США [15]. Однако способность ферментировать мелибиозу характерна для видов S. bayanus и S. mikatae, а также для гибридного таксона S. pastorianus (син. S. carlsbergensis) [2, 16]. Вид S. bayanus представлен двумя разновидностями - S. bayanus var. bayanus и S. bayanus var. uvarum, частично генетически изолированными и отличающимися по последовательностям внутренних транскрибируемых спейсеров рДНК (ITS1 и ITS2) [3, 17, 18]. К виду S. bayanus var. bayanus относится типовая культура вида CBS380 и некоторые другие штаммы, загрязняющие пивоварение, а к виду S. bayanus var. uvarum - многочисленные винные штаммы Mel+. В отличие от S. cerevisiae, штаммы Mel+ дрожжей S. bayanus var. bayanus, S. bayanus var. uvarum, S. pastorianus, S. mikatae и S. paradoxus имеют только по одному гену MEL [5, 19]. Были клонированы и секвенированы ди-вергировавшие гены MEL у дрожжей S. paradoxus (MELp), S. mikatae (MELj) и у типовой культуры S. carlsbergensis (MELx), нуклеотидные последовательности которых сходны с последовательностью гена MEL1 дрожжей S. cerevisiae на 76.8%, 75.1% и 83.0% соответственно [20, 21]. В Генбан-ке имеется нуклеотидная последовательность а-галактозидазного гена S. bayanus var. uvarum (Accession number AF412041). До настоящего времени не известны нуклеотидные последовательности
Таблица 1. Штаммы дрожжей Saccharomyces, используемые в работе
Видовая принадлежность Номер штамма а-галактозидазные гены Происхождение дрожжей Accession number
S. cerevisiae C.B.11 MEL1 Производное штамма NCYC 74 X03102
S. cerevisiae ВКМ Y-1830 MEL2 Ягоды винограда, Россия Z37508
S. cerevisiae OL11-11B MEL6 Сегрегант гибрида CBS 4411 x X2180-1A Z37510
S. bayanus var. bayanus CBS 380 MELb Пиво AY279083*
S. pastorianus CBS 1538 MELpt Пиво AY279084*
S. bayanus var. uvarum NCYC 686 MELu Кока-кола AF412041
S. carlsbergensis CBS 1513 MELx Пиво M58484
S. paradoxus UCD 61-248 MELp Drosophila pseudoobscura, California, USA X95505
S. mikatae IFO 1816 MELj Листья, Япония X95506
Zygosaccharomyces mrakii IFO 1835 MELr Силос, Италия AB030209
Примечание. Сокращенные названия коллекций: ВКМ - Всероссийская коллекция микроорганизмов, Москва; CBS - Cen-traalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Holland; NCYC - National Collection of Yeast Cultures, Norwich, England; UCD - Herman J. Phaff Yeast Culture Collection, Department of Food Science and Technology, University of California, Davis, USA.; IFO - Institute for Fermentation, Osaka, Japan.
* Последовательности, которые определены в данной работе.
генов MEL дрожжей S. bayanus var. bayanus и S. pastorianus.
В данной работе представлены результаты секвенирования генов MEL типовых культур указанных двух видов и проведено сравнение всех известных а-галактозидазных генов комплекса Saccharomyces sensu stricto.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Штаммы, изучаемые в работе, приведены в табл. 1. Для проведения генно-инженерных манипуляций использовали штамм Escherichia coli TG1 [22].
Среды. Дрожжи культивировали при 28°С на полной среде YPD, содержащей (в г/л) бактоагар -20, глюкозу - 20, дрожжевой экстракт - 10 и пептон - 10. Клетки E. coli выращивали при 37°С в жидкой среде LB, содержащей (в г/л) триптон -10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 10, с добавлением при необходимости 100 мкг/мл ампициллина. Трансформацию и отбор клонов проводили на соответствующей агаризованной среде.
ДНК выделяли из клеток дрожжей по методу, описанному ранее [23]. Плазмидную ДНК из клеток E. coli выделяли щелочным методом [24].
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли на ДНК-амплификаторе "Терцик™". Для амплификации генов MEL использовали следующие праймеры: DM-1 - 5'-TTCGCAGATGGGT TGGGACAA-3' и DM-2 - 5'-AAGCTTGCTGGAA CAGTTGTGTT-3', позволяющие амплифициро-
вать ДНК-фрагмент длиной около 1300 п.н. ПЦР проводили в 30 мкл буфера, содержащего 2.5 мМ MgCl2, 0.1 мМ каждого dNTP, 50 пмоль каждого праймера, 2.5 ед.акт. Гад-полимеразы ("Синтол", Россия), 20-200 нг ДНК. Начальная денатурация -94°С в течение 3 мин; следующие 30 циклов в режиме: денатурация - 94°С, 30 с, отжиг - 56°С, 30 с, синтез ДНК - 72°С, 60 с; на последнем цикле -72°С, 10 мин.
Клонирование. ПЦР-продукты элюировали из геля при помощи набора "GeneClean kit", согласно протоколу фирмы-изготовителя ("Bio 101 Inc"., США) и затем встраивали по тупым концам в вектор pTZ57R/T, линеаризованный по сайту Eco321 (изошизомер EcoRV). Компетентные клетки E. coli TG1 трансформировали с использованием набора "InsT/Aclone™ PCR Product Cloning Kit" согласно протоколу фирмы-изготовителя ("MBI Fermentas", Литва). Трансформанты со вставкой отбирали на среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, субстрат X-gal и индуктор IPTG. Затем фрагменты ДНК субклонировали в векторе pUC19.
Секвенирование. Нуклеотидные последовательности по двум цепям определяли с помощью секвенирования по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI 373a ("Applied Biosystems").
Филогенетический анализ. Поиск гомологии с известными нуклеотидными последовательностями проводили по программе BLAST. Множественное выравнивание полученных и уже известных аминокислотных последовательностей осуществ-
Таблица 2. Степень гомологии (%) исследуемого района протяженностью 1251 п.н. разных генов MEL дрожжей комплекса Saccharomyces sensu stricto
MEL1 MEL2 MEL6 MELp MELj MELu MELb MELx
MELpt 77.3 77.9 77.5 77.0 81.7 94.1 94.7 99.3
MELx 77.3 77.7 77.4 76.7 81.3 93.6 94.0 100
MELb 77.4 77.8 77.5 77.5 80.8 99.2 100
MELu 78.1 78.3 78.1 77.4 80.7 100
MELj 74.4 76.9 77.7 76.2 100
MELp 78.3 78.3 79.3 100
MEL6 94.8 94.8 100
MEL2 96.3 100
MEL1 100
100
Примечание. Исследуемые участки генов MELA, MEL5, MEL6, MEL7 и MEL9 имеют 100%-ную гомологию.
ляли с использованием программы CLUSTAL W. Филогенетические родственные связи генов MEL разных видов дрожжей-сахаромицетов и построение дендрограммы устанавливали с использованием программ DNADIST, NEIGHBOR и DRAWGRAM из пакета PHYLIP 3.52 [25]. В качестве внешней группы использовали ген MEL дрожжей Zygosaccharomyces mrakii [26]. Индексы бутстрэпа, определяющие статистическую достоверность выделения групп, определяли для 100 реплик.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Нуклеотидные последовательности генов MELb и MELpt
С помощью праймеров DM-1 и DM-2 из ДНК S. bayanus var. bayanus CBS 380 и S. pastorianus CBS 1538 были амплифицированы фрагменты ДНК длиной примерно 1300 п.н., соответствующие генам MELb и MELpt. Секвенированные по двум цепям вставки имеют длину 1251 п.н.; это покрывает основную часть кодирующей области генов MEL, составляющую 1413 п.н. в случае гена MEL1 [13].
Нуклеотидные последовательности этих двух генов сходны на 94.7% (66 нуклеотидных замен, 46 транзиций, 20 трансверсий), делеций и вставок отдельных нуклеотидов нет. Последовательности сравнили с соответствующими фрагментами последовательностей других генов MEL дрожжей Saccharomyces sensu stricto (табл. 2). Высокая степень гомологии обнаружена между генами MELb и MELu (99.2%, 10 нуклеотидных замен), MELpt и MELx (99.3%, 9 нуклеотидных замен). Последовательность гена MELb
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.