научная статья по теме МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МОНИТОРИНГ СУЛЬФИДОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ У ПАЦИЕНТОВ, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕМ БОЛЕЗНИ ЛАЙМА Биология

Текст научной статьи на тему «МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МОНИТОРИНГ СУЛЬФИДОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ У ПАЦИЕНТОВ, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕМ БОЛЕЗНИ ЛАЙМА»

3. Калюжная Р. А. Физиология и патология сердечно-сосудистой системы детей и подростков. — М.: Медицина, 1973. — 325 с.

4. Баевский Р. М., Кириллов О. И., Клецкин С. 3. Математический анализ изменений сердечного ритма при стрессе. — Л.: Наука. 1984. — 220 с.

5. Матлина Э. Ш., Меньшиков В. В. Методы исследования некоторых гормонов и медиаторов. — М.: 1965. — С. 25—32.

6. Матлина Э. Ш., Софиева И. Э. Методика определения адреналина, норадреналина, дофамина и ДОФА в одной порции мочи // Методы исследования некоторых гормонов и медиаторов. — М., 1965. — С. 23.

7. Псеунок А. А. Влияние образовательных технологий на адаптивные возможности детей и подростков (лонгитудинальное исследование): автореф. дис. ... д-ра биол. наук. — Астрахань, 2005. — 43 с.

8. Матлина Э. Ш., Меньшиков В. В. Клиническая биохимия катехоламинов. — М.: Медицина, 1967. — 304 с.

9. Баевский Р. М., Берсенева А. П., Барсукова Ж. В. Возрастные особенности сердечного ритма у лиц с разной степенью адаптации к условиям окружающей среды / / Физиология человека. 1985. — Т. 11. — № 2. — С. 208—212.

УДК 579.26

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МОНИТОРИНГ СУЛЬФИДОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ У ПАЦИЕНТОВ, ИНФИЦИРОВАННЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕМ БОЛЕЗНИ ЛАЙМА

А. Л. Герасимчук,

научный сотрудник Биологического института Томского государственного университета (ТГУ),

gerasimchuk_ann@mail.ru,

П. А. Бухтиярова,

старший лаборант Биологического института ТГУ, poljan-4ik@mail.ru,

В. В. Тепляшина,

лаборант Биологического института ТГУ, veratep@mail.ru,

Е. В. Комлева,

младший научный сотрудник Биологического института ТГУ, ev_comleva@sibmail.com,

Е. Н. Ильинских,

профессор Сибирского государственного медицинского университета, ilyinskikh@yandex.ru

Молекулярно-биологический анализ накопительных культур из образцов фекалий пациентов Клиники инфекционных болезней и эпидемиологии Сибирского государственного медицинского университета, инфицированых возбудителем болезни Лайма, проведен с помощью методов полимеразной цепной реакции и денатурирующего градиентного гель-электрофореза. Обнаружено присутствие в кишечнике доноров сульфидогенных микроорганизмов, относящихся к представителям Citrobacter и Pyramidobacter.

Molecular analysis of enrichment cultures isolated from feacal samples of patients infected with the agent of Lyme disease has been conducted using polymerase chain reaction and denaturing gradient gel-electro-phoresis. It was found the presence of sufidogenic microorganisms Citrobacter sp. and Pyramidobacter sp. in intestine donors.

Ключевые слова: болезнь Лайма, сульфидоген-ные прокариоты, кишечник человека, ПЦР-DGGE.

Keywords: Lyme disease, sulfidogenic microorganisms, human intestine, PCR-DGGE.

Введение. В Томской области боррелиоз Лайма занимает одно из первых мест среди природно-очаговых инфекций, а заболеваемость колеблется от 70 до 100 случаев на 100 тыс. населения. При этом на один случай клещевого энцефалита приходится 2 случая болезни Лайма. Это инфекционное заболевание обладает большим полиморфизмом клинических проявлений, в том числе, приводит к отключению иммунной системы, что может отрицательно воздействовать на микробиом кишечника. Исследование микробиома кишечника человека в норме и патогенезе является актуальной проблемой при изучении этиологии различных заболеваний.

№ 3, 2011

188

Медицинская экология

Современные исследования неожиданно выявили, что сульфидогенные прокариоты (СП), которые раньше привлекали внимание исследователей благодаря их активности в природных экосистемах, могут в большом количестве содержаться в организме человека [1]. Более того, было обнаружено увеличение численности СП в тканях и тканевых жидкостях пациентов, страдающих холециститом, абсцессами мозга и брюшной полости, а также колитами (острыми и хроническими воспалительными заболеваниями толстой кишки) [2, 3]. Возможное участие СП в этиологии различных заболеваний связывают с цитотоксическим действием сероводорода, являющегося конечным продуктом жизнедеятельности этих микроорганизмов. В современной литературе обсуждается не только цитоток-сическое, но и возможное канцерогенное действие Н^Б, образуемого СП [4]. Мы считаем, что важным аспектом жизнедеятельности СП в кишечнике может быть не только негативное воздействие за счет образования Н^, но и за счет переведения ионов металлов, прежде всего, железа и меди, в нерастворимые сульфиды. Химически высокореакционный сероводород реагирует с доступными ионами металлов с образованием сульфидов металлов, обладающих чрезвычайно низкой константой растворимости, тем самым вызывая дефицит доступных металлов в организме. Процесс образования сульфидов металлов под действием СП хорошо известен для природных экосистем и используется в биотехнологиях очистки от металлов. До сих пор никто не обращал внимания на возможность протекания аналогичных реакций в кишечнике человека и животных.

Задачей этого исследования явилось изучение сообщества СП кишечника пациентов, инфицировнных возбудителем болезни Лайма с помощью современных молекулярных методов, основанных на ПЦР-амплификации генов 16Б рРНК — универсального филогенетического маркера.

Материалы и методы исследования.

Донорами образцов для исследования были пациенты Клиники инфекционных болезней и эпидемиологии Сибирского государственного медицинского университета, инфицированные возбудителем болезни Лайма. Образцы фекалий были получены от четырех доноров мужского пола, собраны в пластиковые емкости и перенесены в 200-мл флаконы со стерильной средой Видделя [5]. Полученный гомогенизированный раствор использовался в качестве иноку-лята при посевах на стандартную пресноводную среду Видделя с пептоном в качестве органического субстрата, а также с пептоном и добавлением ионов двухвалентной меди в концентрации 100 мг/л. Анаэробные условия создавали, доливая 200-мл флаконы питательной средой доверху. Культивирование проводили при 37 °С.

Фазово-контрастную микроскопию накопительных культур проводили с помощью микроскопа AxioImager A1 (Carl Zeiss).

Выделение ДНК микроорганизмов из проб накопительных культур проводили с помощью набора реактивов MO BIO PowerSoil DNA Kit (MO BIO Laboratories, Inc, Carlsbad, CA), следуя инструкции производителя.

Для амплификации полной последовательности гена 16S рРНК использовали праймеры 27F и 1492R. Амплификацию генов проводили с использованием Mastercycler (Eppendorf) по следующей программе: первоначальная денатурация при 95 °С в течение 20 сек; последующие 6 циклов денатурации при 95 °С в течение 10 сек, отжиг прай-меров при 45 °С в течение 20 сек, элонгация праймеров при 72 °С в течение 1,5 мин; последующие 27 циклов денатурации при 95 °С в течение 10 сек, отжиг праймеров при 55 °С в течение 20 сек; элонгация праймеров при 72 °С в течение 1,5 мин; окончательная элонгация при 72 °С в течение 3 мин. Продукты амплификации визуализировали при проведении электрофореза в 1 % ага-розном геле.

№ 3, 2011

Медицинская экология

189

Для анализа микробного сообщества методом денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) проводили амплификацию фрагментов генов 16S рРНК (около 600 пар оснований) с праймерами BacV3f и 907R, используя в качестве матрицы ДНК ПЦР-продук-ты, полученные с праймерами 27F и 1492R. ДГГЭ проводили, используя систему «Dcode System (Biorad laboratories, Hercules, CA, U.S.)». Применяли 8 % полиакриламидный гель с денатурирующим градиентом от 30 до 65 % (100 % денатурирующий раствор содержал 7М мочевину и 40 % формамид). Добавляли 10 % APS и TEMED в качестве полимеризующих агентов. Электрофорез проводили 16 часов в ТАЕ-буфере при 60 °С и 100 V.

Секвенирование последовательностей ДНК осуществляли коммерчески (ЗАО «Синтол»). Анализ последовательностей ДНК проводили с использованием программы BioEdit и инструмента BLAST GenBank (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/).

Результаты и обсуждение. Из проб фекалий нами получены накопительные культуры на среде для сульфидо-генных микроорганизмов. Продолжительность лаг-фазы при культивировании составила от 9 до 12 суток. Признаки образования сульфида (наличие черного нерастворимого осадка) обнаружены в четырех из восьми накопительных культур. Микроскопирование препаратов культур показало большое морфологическое разнообразие бактериальных клеток. Большая часть клеток представлена палочкообразными формами, в некоторых культурах обнаружены спорообразующие бактерии. Наибольшее морфологическое разнообразие бактерий обнаружено в накопительных культурах с пептоном без добавления ионов меди, что связано с ин-гибирующим влиянием этого металла на рост микроорганизмов. Однако несмотря на невысокий уровень разнообразия морфотипов на среде с медью, в этих накопительных культурах появлялись бактерии, не обнаруженные на среде без добавления металла, что сви-

детельствует о селективном развитии устойчивых к меди форм микроорганизмов.

ДГГЭ-анализ (рисунок) подтвердил различие в биоразнообразии накопительных культур, культивированных при разных условиях. Так, ДГГЭ-про-фили культур, полученных из одного образца, но культивированных с пептоном или с пептоном и медью, отличались по количеству и разнообразию фи-лотипов. Анализ секвенированных фи-лотипов представлен в таблице.

Большое количество филотипов, обнаруженных в накопительной культуре 3РС с добавлением меди, показало довольно высокую степень гомологии (98—100 %) с некультивируемыми представителями энтеробактерий рода Citrobacter. Наиболее близкородственными (степень гомологии фрагментов генов 16S рРНК от 97 до 100 %) культивируемыми видами были С. freudii, C. youngae и C. murliniae. Филотип, близкий С. freudii (98 %), обнаружен также в накопительной культуре 3Р без меди. Род Citrobacter объединяет грам-отрицательных колиформных бактерий, которые повсеместно распространены в почве, воде, сточных водах и также обнаружены в кишечнике человека. Эти микроорганизмы могут быть причиной возникновения инфекций. Например, C. freundii связан с абсцессами мозга и менингитом новорожденных [6]. Недавно описан родственный С. freudii штамм Citrobacter sp., выделенный из осадков кислых шахтных

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком