научная статья по теме МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ -ФРУКТОЗИДАЗНЫХ ГЕНОВ SUC ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES Биология

Текст научной статьи на тему «МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ -ФРУКТОЗИДАЗНЫХ ГЕНОВ SUC ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 4, с. 658-668

ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА

УДК 575.852:577.152.321

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ р-ФРУКТОЗИДАЗНЫХ ГЕНОВ

SUC ДРОЖЖЕЙ Saccharomyces © 2014 г. Е. С. Наумова1, А. Ж. Садыкова1, Н. Н. Мартыненко2, Г. И. Наумов1*

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов,

Москва, 117545

2Московский государственный университет пищевых производств, Москва, 125310 Поступила в редакцию 22.10.2013 г.

Принята к печати 18.03.2014 г.

Для изучения молекулярного полиморфизма генов SUC, кодирующих p-фруктозидазу (инвертазу) у дрожжей рода Saccharomyces, сравнивали нуклеотидные последовательности субтеломерных генов SUC3, SUC5, SUC7, SUC8, SUC9, SUC10 дрожжей S. cerevisiae и гена SUCa дрожжей S. arboricola, а также некоторых опубликованных ранее нуклеотидных последовательностей других генов SUC. Анализ спектра нуклеотидных замен показал, что преобладают молчащие транзиции C ^ T, более 80% которых расположено в третьем положении кодона. Выведенные на основании этих последовательностей ами-нокислотые последовательности p-фруктозидаз сходны на 88—100%. Наиболее дивергированы белки SUCa (S. arboricola) и SUCb (S. bayanus), уровень сходства которых с остальными белками SUCне превышает 92%. Виды S. arboricola, S. bayanus, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae и S. paradoxus имеют только по одной копии гена SUC и не накапливают полимерные гены, как это характерно для штаммов S. cerevisiae из промышленных популяций. По-видимому, субтеломерные повторы р-фруктозидаз-ных генов SUC появились в геноме дрожжей S. cerevisiae под воздействием селекционного отбора в процессе их доместикации.

Ключевые слова: дрожжи Saccharomyces, полимерные гены SUC, p-фруктозидаза, инвертаза, нуклео-тидный и аминокислотный полиморфизм, эволюция.

MOLECULAR POLYMORPHISM OF p-FRUCTOSIDASE SUC GENES IN THE YEAST Saccharomyces, by E. S. Naumova1, A. Zh. Sadykova1, N. N. Martynenko2, G. I. Naumov1* (1State Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms, Moscow, 117545 Russia, *e-mail: gnaumov@yahoo.com; 2Moscow State University of Food Production, Moscow, 125310 Russia). Molecular polymorphism of SUC genes encoding p-fructosidase has been investigated in the yeast genus Saccharomyces. We have determined nucleotide sequences of subtelomeric SUC3, SUC5, SUC7, SUC8, SUC9, S UC10 genes of S. cerevisiae and SUCa gene of S. arboricola. Comparisons of nucleotide sequences of all known SUC genes revealed predominance of transitions C ^ T in the third codon position, which are silent. The aminoacids sequences of p-fructosidases studied have identity of 88—100%. Most divergent are SUCa (S. arboricola) and SUCb (S. bayanus), having amino acid identity with the other SUC proteins less than 92%. It was determined that accumulation of the polymeric SUC genes takes place in industrial populations of S. cerevisiae, while the other Saccharomyces species (S. arboricola, S. bayanus, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae and S. paradoxus) each harbor only one SUC gene. Subtelomeric repeats of p -fructosidase SUC genes could appear in the genome of S. cerevisiae under the effect of selection in the course of their domestication.

Keywords: Saccharomyces sensu stricto, polymeric SUC genes, p-fructosidase, invertase, nucleotide and ami-no acid polymorphisms, evolution.

DOI: 10.7868/S0026898414040089

Сахароза — естественный источник углерода для дрожжей рода Басскаготусез. Гидролиз этого диса-харида до глюкозы и фруктозы обычно осуществляется при участии фермента инвертазы (Р-фруктози-дазы), который кодируется полимерными (т.е. ло-

* Эл. почта: gnaumov@yahoo.com

кализованными на разных хромосомах) генами SUC [1, 2]. У редких штаммов сахароза может гид-ролизоваться внутриклеточной а-глюкозидазой (мальтазой) [3]. При транскрипции гена SUC2 дрожжей S. cerevisiae образуются две формы фер-

мента: внутриклеточная негликозилированная инвертаза с неизвестной функцией и периплаз-матическая гликозилированная инвертаза, необходимая для гидролиза сахарозы [4]. Семейство полимерных генов SUC представлено девятью генами, расположенными на разных хромосомах: SUC1 (VII), SUC2 (IX), SUC3 (II), SUC4 (XIII), SUC5 (IV), SUC7 (VIII), SUC8 (X), SUC9 (XIV) и SUC10 (XVI). За исключением SUC2, эти гены локализованы в мобильных субтеломерных районах хромосом [5—11]. Единственный нетеломерный ген SUC2 локализован на расстоянии около 14 т.п.н. от субтеломерных последовательностей левого плеча хромосомы IX [9]. Этот ген, или его нефункциональный аллель suc2° , имеется у всех изученных природных и индустриальных штаммов S. cerevisiae [5, 12—16]. В начале кодирующей области псевдогена suc2 обнаружен стоп-кодон [17].

Согласно современной классификации, род Saccharomyces включает S. cerevisiae и его шесть видов-двойников: S. arboricola, S. bayanus, S. cari-ocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae и S. paradoxus [18—20]. Дрожжи S. cerevisiae стали первым эука-риотическим организмом, последовательность нуклеотидов генома которого была определена [21]. Затем определили последовательности полных геномов дрожжей S. arboricola, S. bayanus, S. kudriavzevii, S. mikatae и S. paradoxus, а также часть генома S. cariocanus [22, 23]. Сравнительный анализ геномов этих видов показал, что наиболее изменчивы теломерные районы хромосом, в которых локализованы семейства генов, контролирующих ферментацию различных сахаров, включая сахарозу. Хромосомная локализация генов SUC2 дрожжей S. bayanus, S. kudriavzevii, Smikatae и S. paradoxus одинакова, тогда как аналогичный ген S. cariocanus расположен в хромосоме XV, в области реципрокной транслокации [22, 24]. В настоящее время известно всего четыре штамма дрожжей S. arboricola из континентального Китая и о. Тайвань [25, 26]. Хромосомная локализация гена SUC у этих дрожжей не известна. Установлено, что культурные дрожжи S. cerevisiae, участвую -щие в ферментационных процессах хлебопечения, пивоварения и производства спирта, могут обладать дополнительными теломерными генами SUC1, SUC3-SUC5, SUC7—SUC10 в различных комбинациях [13, 15, 16, 27]. Теломерные гены SUC у других видов рода Saccharomyces не обнаружены.

Ген SUC2 состоит из 1596 п.н. и кодирует полипептид из 532 аминокислот [28]. Определены нук-леотидные последовательности теломерных генов SUC1 и SUC4 дрожжей S. cerevisiae [29]. Нуклеотид-ные последовательности генов SUC2 видов S. paradoxus, S. kudriavzevii, S. mikatae и S. bayanus имеются в международных компьютерных базах данных (AABY01000004, AAC101000133, AABZ01000015 и AACA01000015 соответственно). Известна также

последовательность гена SUC2 дрожжей S. cariocanus [24].

Полимерные гены SUC представляют большой интерес для изучения внутривидовой и межвидовой эволюции ферментов. В настоящей работе проведен сравнительный анализ ß-фруктозидаз-ных генов из штаммов дрожжей Saccharomyces различного происхождения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты исследования. Используемые в работе штаммы дрожжей Saccharomyces приведены в таблице. Дрожжи культивировали при 28°С на полной среде YPD (бакто-агар — 20, глюкоза — 20, дрожжевой экстракт — 10 и пептон — 20; г/л).

ПЦР. Дрожжевую ДНК выделяли при помощи набора Genomic DNA Purification Kit ("Fermentas", Литва). Для амплификации генов SUC использовали праймеры SD1 (5'-ATGCTTTTGCAAGCTTTC-3') и SR (5'-GGTCATGTTCACAGATCC-3'). ПЦР проводили в 30 мкл буфера, содержащего 2.5 мЫ MgCl2, 0.1 мИ каждого dNTP, 50 пмоль каждого праймера, 2.5 единицы Taq-полимеразы ("Син-тол", Россия), 20—200 нг ДНК по следующей схеме: начальная денатурация ДНК при 940С в течение 3 мин; затем 30 циклов в режиме: денатурация при 940С — 30 с, отжиг праймеров при 560С — 30 с, синтез ДНК при 720С — 60 с; конечная достройка при 720С — 10 мин. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1%-ном агарозном геле при 60-65В в 0.5xTBE буфере (45 мН Трис-На, рН 8.0, 10 м1 EDTA, 45 мM борная кислота) в течение 2—3 ч. Гель окрашивали бромистым эти-дием, промывали в дистиллированной воде и фотографировали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Vilber Lourmat (Франция). В качестве маркера молекулярных весов использовали препарат "1kb DNA Ladder" ("Fermentas").

Определение нуклеотидных последовательностей и филогенетический анализ. Амплифициро-ванньге фрагменты генов SUC элюировали из геля при помощи набора "DNA Extraction Kit" ("Fermentas") согласно протоколу фирмы-изготовителя. Нуклеотидную последовательность ПЦР-про-дуктов по двум цепям определяли при помощи четырех праймеров — SD1 и SR, а также SUC26 (5'-AGATCAACCCATTGCTATCGC-3') и SUC27 (5'-CCTTCCAAATCTTATTGGGTC-3''), комплементарных участку внутренней области гена на автоматическом секвенаторе "Beckman-Coulter" (США). Последовательности анализировали, используя программу SeqMan package ("DNA Star Inc.", США), гомологии с известными нуклеотидными последовательностями генов SUC определяли по программе BLAST Mножественное выравнивание нук-леотидных и аминокислотных последовательностей проводили вручную, используя программу BioEdit

MОЛEКУЛЯPHAЯ БИОЛОГИЯ том 48 № 4 2014

9*

Происхождение изученных штаммов дрожжей Басскаготусез

Штамм Источник и место выделения Гены БиС Регистрационный номер в базе данных GenBank

1 2 3 4

Saccharomyces cerevisiae

S288C* Генетическая линия SUC2 V01311

1.99.-9A Генетическая линия suc2° X13982

NBRC 2043 Пекарские дрожжи, Япония SUC2 AB534206

NBRC 2375 Пекарские дрожжи, Япония SUC2 AB534206

HP 203 Пекарские дрожжи, Япония SUC2 AB534208

NBRC 0224 Спиртовые дрожжи, Япония SUC2 AB534214

NRIC 0057 Ферментированный рис, Филиппины SUC2 AB534216

NRIC 0059 Ферментированный рис, Филиппины SUC2 AB534217

NRIC 0060 Ферментированный рис, Филиппины SUC2 AB534217

NRIC 0061 Ферментированный рис, Филиппины SUC2 AB534218

NBRC 2347 Саке, Япония SUC2 AB534219

OC2 Вино, Япония SUC2 AB534220

АК 46B, Сегрегант штамма АК46. SUC2 AB495285

АК 46А Забродившая вишня, Япония AB495286

WS 06 Хлебное дерево, Самоа SUC2 AB534221

NBRC 10514 Экссудат дерева, Япония SUC2 AB534222

NBRC 1

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком