БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 4, с. 309-315
УДК 577.3
МОНИТОРИНГ ВЫБРОСА ATP ИЗ ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК МЕТОДОМ
БИОСЕНСОРА
© 2007 г. Р. А. Романов, А. А. Хохлов, М. Ф. Быстрова, О. А. Рогачевская,
Ю. Е. Яценко, С. С. Колесников
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3; факс: 8-(4967)-33-0509; электронная почта:
cheglok@rambler.ru Поступила в редакцию 16.03.2007 г.
Аденозин-5'-трифосфат (ATP) используется центральной и периферической нервными системами в качестве нейромедиатора/нейромодулятора. В частности, ATP является афферентным нейромеди-атором в периферическом вкусовом органе - вкусовой почке. Чтобы исследовать механизмы секреции ATP одиночными вкусовыми клетками, мы разработали метод для мониторинга нуклеотида во внеклеточном пространстве, основанный на регистрации активности клеток, способных отвечать на экстраклеточный ATP. Использовались клетки линий НЕК-293 и COS-1, экспрессирующие эндогенные P2Y-рецепторы, а также клетки линии HEK-293, трансфицированные кДНК, кодирующей Р2Х3-рецептор. По большинству показателей (порог чувствительности, время инактивации ATP-ответа, рефрактерный период) клетки линии COS-1 оказались наиболее удобными для использования в качестве АТР-сенсоров. Кроме того, оказалось, что клетки линии НЕК-293 экспрессиру-ют механочувствительные Са-проницаемые катионные каналы, стимуляция которых механическими стимулами, например при аппликации растворов, может приводить к возбуждению этих клеток. Это является существенным препятствием в применении клеток НЕК-293 в качестве сенсоров на химические стимулы. Ответы клеток линии COS-1 на ATP связаны с мобилизацией внутриклеточного Са2+, что позволяет регистрировать активность исследуемых клеток электрофизиологическими методами и одновременно отслеживать секрецию ATP по Са2+-ответам клеток COS-1. С помощью описанного метода показана секреция ATP одиночными вкусовыми клетками мыши в ответ на деполяризацию.
Недавние физиологические эксперименты [1] с использованием мышей, у которых была подавлена (knock-out) экспрессия ионотропных пуриноре-цепторов P2X2- и Р2Х3-типа, показали, что для этих генетически модифицированных животных характерно практически полное подавление чувствительности к вкусовым веществам всех модальностей на уровне активности вкусового нерва. Кроме того, у этих животных значительно ослаблены поведенческие реакции на вещества со вкусом сладкого, горького и умами (umami - вкус глу-тамата и некоторых других аминокислот). Известно также, что субъединицы рецепторов P2X2 и P2X3 формируют гетеромерный рецепторный комплекс на нервных окончаниях афферентного нерва, ин-нервирующего вкусовые почки [1, 2]. Перечисленные факты свидетельствуют о том, что периферический вкусовой орган - вкусовая почка - использует ATP в качестве афферентного нейромедиатора. Следовательно, секреция ATP должна представлять собой финальную стадию процесса вкусовой трансдукции во вкусовых клетках.
Традиционно концентрация ATP в среде измеряется с помощью люциферин-люциферазной реакции. Чувствительность этого метода достаточно
высока (~10-11 M), что позволяет детектировать высвобождение ATP в суспензии клеток и препаратах тканей. Хотя теоретически этот метод может быть использован для детектирования ATP, полностью высвободившегося из одной клетки в объеме 100 мкл, его применение обычно требует довольно большой плотности клеток (>104 мл-1) и продолжительного времени интегрирования (~10 с) хемилюминесцентного сигнала [3]. Исследование стимул-зависимой секреции ATP, в процессе которой высвобождается незначительная часть внутриклеточного ATP, требует еще большей плотности клеток при использовании люциферин-люци-феразного метода.
Другим приемом для мониторинга секреции сигнальных молекул исследуемыми клетками является использование клеток-биосенсоров, которые экспрессируют рецепторы к данному лиганду и поэтому способны генерировать клеточные ответы при кратковременном появлении химического стимула в экстраклеточной среде. С помощью такого метода ранее исследовался выброс ацетил-холина [4-6], глутамата [7], ГАМК [8], ATP [9, 10] и серотонина [11]. Мы применили этот подход для того, чтобы установить, действительно ли вкусо-
10 мкМ АТР
250 мс
А
с
0 0 5
через 6 мин через 12 мин
А1 с н
о
100 мкМ АТР _
через 7 мин
10 с
1 Время, с
Рис. 1. Ответы клеток линии НЕК-293, экспрессирующих экзогенные Р2Хз-рецепторы, на экстраклеточный ATP. а -Активация входящего тока в ответ на быструю аппликацию 10 мкМ ATP. Подобные токи не наблюдались в нетрансфи-цированных клетках. • - При использовании системы быстрой аппликации стимулов (как в а) клетки способны отвечать на ATP многократно при рефрактерном периоде около 5 мин. в - Продолжительная аппликация 100 мкМ АТР при смене раствора со скоростью около 0.1 мл/с вызывала значительно редуцированные ответы; при повторной аппликации ответы практически исчезали. „ - Инактивация АТР-зависимых токов в присутствии 100 мкМ ATP с характерным временем порядка 200 мс. Кривая релаксации тока получена усреднением трех независимых регистраций.
0
вые клетки способны секретировать ATP в ответ на их стимуляцию. В данной работе мы провели сравнительный анализ двух ATP-биосенсоров для того, чтобы найти оптимальные условия исследования секреции ATP одиночными клетками, прежде всего - вкусовыми.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Культура клеток. В экспериментах использовались клетки линий НЕК-293 и COS-1. Клетки культивировались в среде DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, "Gibco", США) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки и 100 мкг/мл гентамицина при плотности посева примерно 105 клеток на 35-мм чашку Петри во влажной атмосфере с 5% CO2. Для эксперимента клетки обрабатывали 0.25% раствором трипсина, собирали в 1.5-мл пробирку и промывали физиологическим раствором [12].
Молекулярное клонирование и трансфекция.
Полноразмерная последовательность кДНК, кодирующая рецептор P2X3 крысы, была наработана с помощью одноступенчатой RT-PCR (набор One-Step RT-PCR with platinum Taq Hi-Fi, "Invitro-gen", США) в соответствии с рекомендациями производителя и с использованием ген-специфических праймеров (прямой: 5'-TAAGTGGCTGTGAG-CAGTTTCTC-3'; обратный: 5'-GGAAGCATTGC-CTATCTGTTGAA-3'), сконструированных ранее
[13]. В качестве матрицы использовалась тотальная РНК, выделенная из ткани мозга крысы, с применением RNeasy RNA isolation kit ("Qiagen", Германия) согласно протоколу производителя. PCR-фрагмент напрямую клонировали в вектор pGEM-T Easy ("Promega", США). Последовательность P2X3 затем вырезали из вектора pGEM-T Easy с помощью эндонуклеазы рестрикции EcoR1 и клонировали по соответствующему сайту в вектор pIRES2-EGFP ("Clontech", США), обработанный тем же ферментом. Полученной плазмидой, несущей ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP), трансфицировали клетки линии НЕК-293. Для временной трансфекции 1.6 мкг pIRES2-EGFP с геном P2X3 и 4 мкг липофектамина ("Gibco", США) добавлялись к клеткам НЕК-293 (3-5 х 103 клеток на 35-мм чашку Петри). После инкубации в течение 5-6 ч при 37°С среду заменяли на обычную культуральную среду. Регистрации проводились через 24-72 ч после трансфекции. Качество трансфекции оценивалось по интенсивности свечения GFP.
Электрофизиология и микрофлуориметрия.
Для исследования выброса ATP вкусовыми клетками одиночные клетки вкусовых почек изолировали из желобоватого и листовидного сосочков языка мыши по ранее описанной методике [14].
Электрическая активность клеток линии НЕК-293 и вкусовых клеток регистрировалась методом perforated patch clamp с помощью усилителя Axo-
МОНИТОРИНГ ВЫБРОСА ATP ИЗ ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК МЕТОДОМ БИОСЕНСОРА 311 7 мм рт. ст.
0 мм рт. ст.
1 мМ Са2+
0 мМ Са2+
F/Fo
5 -
0 L I_I_I_I_I_I_
0 100 200 300 400 500
Время, с
Рис. 2. Вход Ca2+ через механочувствительные Са2+-проницаемые каналы в клетках линии НЕК-293. Верхняя линия -давление, приложенное к регистрирующей микропипетке при регистрации в конфигурации "cell-attached". Средняя линия - содержание Ca2+ в экстраклеточном растворе. Внизу - относительное изменение во времени флуоресценции клеток НЕК-293, содержащих Са2+-зонд Fluo-4; F - интенсивность флуоресценции в данный момент времени, F0 - средняя интенсивность флуоресценции непосредственно перед стимуляцией клетки.
patch 200 B, ЦАП-АЦП конвертера DigiData 1322A и пакета лицензионных программ pClamp8.0 (все "Axon Instruments", США). Системы перфузии обеспечивали смену экстраклеточного раствора со скоростью 0.1-1 мл/с [15]. Регистрирующие пипетки содержали (в мМ): 140 CsCl, 1 MgCl2, 0.5 EGTA, 10 HEPES-KOH (CsOH) и 400 мкг/мл амфотерици-на Б. Базовый экстраклеточный раствор включал (в мМ): 140 NaCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES-NaOH.
Изменения концентрации Ca2+ в цитоплазме клеток линий НЕК-293 и COS-1 определяли с помощью флуоресцентного Ca2+-зонда Fluo-4. Для визуализации флуоресцентного сигнала использовали ICCD-камеру IC-200 ("Photon Technology International", США), установленную на микроскопе Axioscope-2 с водно-иммерсионным объективом Achroplan-40, NA = 0.8 ("Zeiss", Германия). Для внутриклеточной загрузки зонда клетки инкубировали в течение 35 мин в присутствии 2-4 мкМ Fluo-4AM и 0.02% Pluronic (оба из "Molecular Probes", США) при комнатной температуре. Флуоресценция возбуждалась при длине волны 480 нм при помощи осветителя на сверхъярких излучающих полупроводниковых диодах с волоконно-оптическим выходом для микрофотометрических исследований клеток [16]. Излучение эмиссии фильтровалось при помощи интерференционного узкополосного фильтра Chroma (535 ± 20 нм), и последовательные флуоресцентные изображения регистрировались каждые 0.5-2 с при помощи программы ImagingWorkBench 5.2 ("INDEC Biosystems", США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве ATP-биосенсора мы сначала попытались использовать клетки линии НЕК-293. Это стабильная и неприхотливая линия, которая широко применяется для клеточных исследований. Клетки НЕК-293 эндогенно экспрессируют мета-ботропные P2Y-рецепторы, сопряженные с фос-фоинозитидным каскадом [17], и поэтому чувстви
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.