РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 1, с. 30-38
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К ХИМИЧЕСКИМ КАНЦЕРОГЕНАМ ГРУППЫ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ
© 2009 г. А.Н. Глушков*, С.В. Апалько*, В.А. Матвеева**, М.В. Костянко***, С.В. Черно****
* Институт экологии человека СО РАН, г. Кемерово, Россия **Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,
г. Новосибирск, Россия ***Кемеровский государственный университет, г. Кемерово, Россия;
****Кемеровская государственная медицинская академия, г. Кемерово, Россия Поступила: 12.01.09 г. Принята: 02.02.09 г.
Воздействие химических канцерогенов на организм человека является одним из главных этиологических факторов онкологических заболеваний. Ранее в модельных экспериментах на животных было показано, что индукция специфического иммунного ответа против химических канцерогенов приводит к торможению возникновения и роста кан-церогениндуцированных опухолей. В основу создания антиканцерогенных вакцин для профилактики рака у человека заложены два принципа: такие вакцины должны индуцировать синтез специфичных антител и не должны содержать химических канцерогенов, чтобы избежать ятрогенного канцерогенеза. При помощи технологии фагового дисплея возможно получение пептида, обладающего конформационной гомологией с химическим канцерогеном. Для этого необходимы высокоспецифические антиканцерогенные антитела. В данной статье описано получение и дана иммунологическая характеристика мАТ В2 к benzofajpyrene, являющегося безусловным канцерогеном для человека. С помощью конкурентного и неконкурентного вариантов иммуноферментного анализа показано, что мАТ В2 обладает высоким аффинитетом к benzofajpyrene и benzfajanthracene — вероятному канцерогену для человека. Кросс-реактивность мАТ В2 с chrysene, anthracene, pyrene, naphthalene, 1 lH-benzofajfluorene, 1 lH-benzofbjfluorene, fluoranthene, fluorene, stilbene оказалась низкой. С progesterone, pregnenolone, estron, estradiol, а также с такими ароматическими аминокислотами как tryptophan и phenylalanine перекрестного реагирования не было. Эти свойства определяют большую пригодность полученного мАТ В2 для поиска пептидов-иммуномиметиков benzofajpyrene и benzfajanthracene по сравнению с зарубежными аналогами, которые характеризуются выраженной кросс-реактивностью с неканцерогенными полициклическими ароматическими углеводородами.
Ключевые слова: полициклические ароматические углеводороды, benzfajanthracene, benzofajpyrene, chrysene, кросс-реактивность
ВВЕДЕНИЕ
Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) присутствуют в качестве загрязнителей как производственной, так и окружающей сред. Многие ПАУ классифицированы как профессиональные канцерогены. Веп7о[а]ругепе (Вр) является первым соединением группы ПАУ, для которого была доказана сначала канцерогенная, а потом и
Адрес: 650002, Россия, г. Кемерово, ул. Авроры, 4-33. E-mail: apalko@ngs.ru
мутагенная активность. Его содержание коррелирует с общим содержанием ПАУ в образцах, взятых на анализ загрязнения среды, а аддукты Bp с белком и ДНК являются биомаркерами влияния ПАУ на организм человека и животных f1j. В связи с этим, многие работы, выполняемые в направлении профилактики воздействия химических канцерогенов, прежде всего, акцентированы на защите организма человека и животных от Bp.
Впервые идея об иммунопрофилактике рака была высказана Creech H.J. et al. в 1939 г., когда в результате ряда экспериментов было установлено, что АТ, индуцирован-
ные химическими канцерогенами, способны тормозить развитие канцерогенеза [2]. Современные исследования, направленные на изучение функции специфических АТ модулировать метаболизм и биологические эффекты Вр, также подтверждают, что наличие таких АТ в организме человека в оптимальном количестве способно снизить риск развития рака [3, 4].
В 1992 г. ^адпа^ .1.Ь. е! а1. [5] в качестве кандидатов на роль антиканцерогенных вакцин предложили использовать моноклональ-ные антиидиотипические АТ. Они не содержат в своем составе канцерогена и в то же время несут в себе его так называемый «внутренний иммунологический образ», и поэтому способны индуцировать синтез соответствующих антиканцерогенных АТ. Было показано, что иммунизация животных моно-клональными антиидиотипическими АТ к Вр приводит к торможению появления и роста химически индуцированных опухолей. Однако, их использование в качестве антиканцерогенных вакцин имеет ряд недостатков, среди которых — возможное появление сопутствующих АТ против видовых, аллогенных и изо-типических эпитопов и развитие нежелательных аллергических реакций.
В ИЭЧ СО РАН совместно с ИХБФМ СО РАН разрабатывается новый подход к созданию антиканцерогенных вакцин, основной идеей которого является получение пептида, модулирующего иммунные функции низкомолекулярного соединения, такие как индукция антиканцерогенных АТ и торможение канцерогенеза. Такой пептид-иммуномиметик так же, как и моноклональ-ные антиидиотипические АТ, не будет содержать канцерогена, способного индуцировать возникновение опухоли, а также сопутствующих антигенных детерминант, вызывающих побочные патологические осложнения. Осуществить задуманное возможно, используя технологию фагового дисплея, которая будет заключаться в отборе пептида, специфично связывающегося с мАТ к химическому канцерогену, конкретно — к Вр.
На данный момент в мире существует несколько мАТ против Вр (США, Чехия, Япония), целью создания которых, главным образом, являлась разработка тест-систем ИФА на выявление загрязняющих агентов группы ПАУ в среде и их метаболитов и аддуктов с ДНК в биологических жидкостях человека и животных. Основным недостатком для ис-
пользования таких мАТ в получении специфического компонента вакцины является их недостаточная специфичность связывания с Bp по сравнению с неканцерогенными ПАУ. Кроме того, зарубежные мАТ не исследованы на способность к связыванию с гидрофобными эндобиотиками (стероидными гормонами) и ароматическими аминокислотами.
Целью настоящей работы является получение высокоспецифичного мАТ к Bp и анализ его перекрестного реагирования с другими соединениями группы ПАУ, стероидными гормонами и ароматическими аминокислотами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Синтез конъюгатов ПАУ-белок
Конъюгаты Bp, benz [a] anthracene (Ba), anthracene, chrysene (Chr), pyrene синтезировали методом ковалентного связывания альдегидной группы гаптена с аминогруппами белка-носителя [7, 8] по следующим положениям: Bp-6-, Ba-7-, anthracene-9-, Chr-6-, pyrene-1-. Полученные конъюгаты содержали 15 ±2 молекулы гаптена на 1 молекулу белка-носителя. В качестве белка-носителя использовали BSA и дрожжевую гексокиназу. Для иммунизации использовали конъюгат Bp-BSA. Для последующей характеристики мАТ в ИФА использовали также конъюгаты гаптен-BSA. Конъюгаты гаптен-гексокиназа использовали для скрининга гибридом, продуцирующих мАТ к ПАУ в дот-блот анализе, а также для получения аффинных сорбентов ПАУ-гексокиназа-Sepharose 4В [9, 10], что позволяло избежать предварительной очистки асцитной жидкости от сопутствующих АТ против белка-носителя, используемого при иммунизации (АТ против БСА).
Получение и скрининг мышиных гибридом
Четырех 8-недельных самок мышей линии BALB/c иммунизировали по следующей схеме: 1, 3, 7 недели — по 150 мкг конъюгата Bp-BSA в смеси с FCA (Sigma) в подушечки задних лап; 10 неделя — 450 мкг Bp-BSA в смеси с FIA внутрибрюшино и в подушечки задних лап; 12 неделя — 200 мкг Bp-BSA в забуферен-ном физиологическом растворе внутрибрю-шино и в подушечки задних лап. В течение последней недели иммунизации образцы сыворотки крови мышей были протестированы при помощи дот-блот анализа на активность АТ. Те животные, которые показали наибольший титр АТ против Bp-BSA, были отобраны для дальнейшей гибридизации.
Гибридомы получали посредством слияния клеток мышиной миеломы Sp2/0 (200 млн. клеток) и спленоцитов и клеток лимфоузлов иммунной мыши (около 100 млн. клеток) с помощью раствора полиэтиленгликоля 1500 (Boechringer Mannheim, Germany) по протоколу, описанному Kohler и Milstein [11].
Скрининг супернатантов гибридом проводили методом дот-блот анализа. На нитро-целлюлозную мембрану наносили раствор конъюгата Bp-гексокиназа в концентрации 0,2 мг/мл. Участки неспецифического связывания насыщали в течение 30 мин TBS (0,02 М Tris-HCl, 0,15 M NaCl, pH 7.5) с добавлением 0,1%-го казеина. Затем инкубировали со 100 мкл исследуемых образцов, разбавленных в отмывочном буфере TBST (TBS с добавлением Tween20 до конечной концентрации 0,5%), содержащим 0,1% казеина, в течение 2 часов. Мембрану промывали 5 раз TBST и затем инкубировали в течение 1 часа с раствором перо-ксидазного конъюгата антител кролика против IgG и IgM мыши (ЗАО «БИОСАН», Россия). После повторной промывки TBST мембрану инкубировали при постоянном перемешивании в течение 30 мин со 100 мкл раствора субстара (TBS, 0,18 мг/мл 4-хлор-1-нафтол, 0,01% перекись водорода) для определения наличия пероксидазной активности. Реакцию останавливали промыванием мембраны водой. Титр АТ в положительных образцах определяли как последнее разбавление, при котором еще наблюдалось пятно. Положительные образцы тестировали по тому же принципу на взаимодействие с anthracene-BSA, Ba-BSA, Chr-BSA, pyrene-BSA. В качестве отрицательного контроля на мембрану сорбировали BSA, а в качестве положительного контроля для сравнения степени перекреста использовали поликлональную мышиную сыворотку, полученную от иммунной мыши, клетки которой были использованы для получения гибридом.
Аффинная очистка антител
Иммобилизацию конъюгата Bp-гексокиназа на бромциан Сефарозу 4В (Pharmacia, NJ) производили в соответствии с протоколом Pharmacia. Асцитную жидкость наносили на колонку, промывали PBS (137 mM NaCl, 2.68 mM KCl , 8.1 mM Na2HPO4 • 12H2O, 1.47 mM KH2PO4, рН 7.5), а затем элюировали присоединившиеся АТ 0,1 М глициновым буфером (рН 2,5). Полученные АТ диализовали в течение суток против PBS. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически.
Неконкурентный и конкурентный ИФА
В лунки полистирольных планшетов («Мед-п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.