РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 2(11), № 4 с. 398-404
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ J-ЦЕПИ ПОЛИМЕРНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
© 2008 г. М.П. Самойлович, И.В. Грязева, Б.В. Климович, А.К. Артемьева, М.Н. Писарева, В.Б. Климович
ФГУ «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Росмедтехнологий, Санкт-Петербург, Россия
Поступила: 04.03.08 г. Принята: 25.04.08 г.
J-цепь — консервативный белок, обеспечивающий образование полимерных IgA, IgM и их перенос через эпителий в секреты слизистых. До сих пор не установлена принадлежность J-цепи ни к одному из известных молекулярных семейств. Остаются неизвестными её эволюционный возраст, третичная и антигенная структуры. Цель работы состояла в создании панели моноклональных антител (МкАт) против J-цепи, изучении их эпитопной специфичности, перекрёстной реактивности и способности выявлять J-цепь, свободную или в составе полимерных Ig. Иммуногенами служили: J-цепь, выделенная из IgM-пара-протеина человека, и рекомбинантная полноразмерная J-цепь, продуцируемая созданным в лаборатории штаммом E. coli. Получено девять клонов мышиных гибридов. Синтезируемые ими МкАт выявляют на J-цепи человека девять линейных антигенных детерминант, четыре из которых являются видоспецифичными для человека, а пять других относятся к числу эволюционно консервативных. Одно из МкАт наряду с J-цепью человека связывает гомологичные белки мышей и крыс, а также четырех других исследованных видов млекопитающих. Несколько МкАт распознают J-цепь в составе нативного секреторного IgA. Полученные МкАт позволяют выявлять J-цепь методами иммуноблотинга, твердофазного ИФА и иммуногистохимии. Таким образом, впервые полученное семейство МкАт против J-цепи открывает принципиально новые возможности для выявления, выделения и исследования структуры и функций молекул полимерных Ig и J-цепи с использованием как клинического материала, так и экспериментальных моделей.
Ключевые слова: J-цепь иммуноглобулинов, моноклональные антитела, SIgA, IgM, полимерные иммуноглобулины
ВВЕДЕНИЕ
J-цепь — пептид, обеспечивающий образование полимерных иммуноглобулинов (pig), их перенос через эпителий слизистых покровов и присоединение к ним секреторного компонента (SC). J-цепь состоит из 137 аминокислот, отличается высоким содержанием отрицательно заряженных остатков аспара-гиновой и глютаминовой кислот, низким содержанием фенилаланина, глицина, серина и отсутствием триптофана [1]. Из восьми остатков цистеина шесть участвуют в образовании внутрицепочечных дисульфидных связей, а два образуют связи с тяжелыми ц- или а-це-пями. J-цепь представляет собой белок, труд-
Адрес: 197136, Санкт-Петербург, ул. Гатчинская, д. 9, кв. 18. E-mail: vklim@sertolovo.ru, vklimovich@gmail.com
ный для выделения и изучения, поскольку в очищенном виде обладает малой растворимостью, чувствителен к протеолизу, а его массовая доля в составе pig составляет 1 — 2% [2]. Данные иммунохимического анализа, полученные с помощью поликлональных антител, а также результаты изучения структуры генов, кодирующих этот белок, свидетельствуют о высокой консервативности J-цепи у животных разных таксонов, при этом ее происхождение и эволюционный возраст остаются неясными [3]. До сих пор J-цепь не отнесена ни к одному из известных молекулярных семейств, не описана ее антигенная структура.
Наличие J-цепи является отличительным признаком pig, а выявление J-цепи в их составе — подходом к иммунохимической детекции pig в присутствии мономерных Ig (mig). В то же время J-цепь в pig, особенно в igM, ма-
скирована прилегающими тяжелыми цепями 1д, поэтому обнаружение ее сопряжено с предварительной обработкой р1д восстанавливающими агентами [4]. Антитела, способные надежно и специфично распознавать эпитопы ,1-цепи в нативном димерном 1дА или в секреторном 1дА ^1дА), до сих пор не описаны. Создание таких реагентов позволило бы выявлять порознь р1дА и т1дА, что способствовало бы совершенствованию методов диагностики некоторых заболеваний человека, например, 1дА-нефропатии [5].
Цель работы состояла в создании панели моноклональных антител (МкАт) против ,1-це-пи, изучении их эпитопной специфичности, перекрёстной реактивности и способности выявлять ,1-цепь, свободную или в составе р1д.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Антигены и антитела. IgM-парапротеины выделяли из образцов сывороток крови пациентов с болезнью Вальденстрема переосаждением глобулиновой фракции сульфатом аммония и последующим диализом против дистиллированной воды [6].
Препарат J-цепи человека получали из па-рапротеина IgM каппа-типа восстановлением дисульфидных связей 0,05 М дитиотреитолом (Sigma) при КТ в течение 2 часов с последующим алкилированием иодацетамидом (Sigma) и фракционированием на колонке с сефакри-лом S-300 (Pharmacia). Наличие J-цепи определяли методами ИФА с помощью МкАт M19/9J (RDI) и JC-88 (Chemicon). Присутствие фрагментов Ig контролировали с помощью созданных в лаборатории МкАт против легких и тяжелых цепей Ig человека [7, 8]. На основе этих же МкАт готовили иммуносор-бенты для удаления из препаратов примесей Ig. Выделенную из сыворотки J-цепь обозначали h-J.
SIgA выделяли из молозива путем сочетания ионнообменной хроматографии и гель-фильтрации [9]. При скрининге гибридом и изучении специфичности МкАт использовали SIgA и IgM нативные, а также восстановленные путем инкубации сначала в течение 1 часа при КТ в 0,05М дитиотреитоле, затем в течение 30 мин в 0,15 M иодацетамиде (обозначены SH-SIgA и SH-IgM, соответственно).
Источником J-цепи при исследовании перекрестной реактивности МкАт служили сыворотки крови свиньи, лошади, собаки, кошки, кролика, крысы, мыши.
Меченные пероксидазой хрена аффинно очищенные кроличьи антитела, приготовленные в лаборатории служили для выявления Ig мышей при постановке иммуноблотинга, а также различных вариантов ИФА.
Для получения рекомбинантной J-цепи человека (r-J) был выбран участок кДНК, содержащий 3 последних экзона гена. Полученный в ПЦР фрагмент был обработан рестриктаза-ми и лигирован в вектор pRSET A (Invitrogen), которым трансформировали клетки E. coli штамма TOP10. Плазмиды из 5 рекомбинант-ных клонов были секвенированы, затем из одного клона был выделен вектор, которым трансформировали клетки E. coli штамма BL21 DE3 pLys(S). Экспрессию белка индуцировали в жидкой культуре добавлением 1 мМ изопропилтиогалактозида (Helicon). Лизат бактерий анализировали электрофорезом в денатурирующем акриламидном геле. Соответствие продуцируемого белка J-цепи подтверждали методом «дот» анализа с помощью кроличьей антисыворотки против J-цепи человека (Biogenex, PU047-UP). Полученный белок после очистки на колонке с никель-сефа-розой (Novagen) использовали для иммунизации мышей и скрининга гибридом.
Конъюгат r-J с пероксидазой хрена (Sigma) готовили методом периодатного окисления [10]. Этот же метод использовали для приготовления конъюгатов кроличьих антимышиных антител, а также МкАт.
Иммунизация мышей, получение гибридом и МкАт. Инбредных мышей-самок SJL/J иммунизировали препаратом h-J в дозе 7 мкг в объеме 0,05 мл внутрикожно сначала в полном, через месяц — в неполном адъюванте Фрейн-да (Sigma), еще через месяц им вводили внут-рибрюшинно 40 мкг h-J в физиологическом растворе. Спустя 1,5 месяца животные получили четыре внутрибрюшинных инъекции по 5 мкг r-J. После месяца интервала мышам в течение недели трижды внутрибрюшинно ввели раствор r-J и через 48 часов после последней инъекции от них получали спленоциты.
Слияние спленоцитов и клеток миелом-ной линии 653А [11] проводили с помощью ПЭГ (Sigma) по стандартной методике [12]. Для роста и клонирования гибридов использовали среду ДМЕМ (Sigma) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (Биолот, Санкт-Петербург). Гибридомы клонировали методом лимитирующих разведений на фидерном слое из перитонеаль-ных макрофагов. Для получения МкАт-со-держащих асцитов стабильно растущие
клоны гибридом в дозе 5—10 х 106 клеток прививали в/б мышам F1(SJLxBALB/c) через 10 дней после инъекции минерального масла — пристана (Sigma).
МкАт выделяли из асцитических жидкостей двукратным осаждением полунасыщенным нейтральным раствором сульфата аммония (НПО Экрос, Санкт-Петербург). Для очистки антител применяли аффинную хроматографию на белок^-сефарозе (Pharmacia).
Иммуноферментный анализ. Скрининг гибридом, определение активности и специфичности МкАт проводили методом непрямого ИФА, используя антигены, адсорбированные в лунках планшетов (NUNC). Эпитопную специфичность МкАт изучали в двух вариантах ИФА, основанных на применении меченного ферментом антигена [13]. Один из них состоял в адсорбции в лунках планшетов первого МкАт (МкАт-1), выделенного из асцитической жидкости. Второе МкАт (МкАт-2) в отдельном планшете в течение 18 час инкубировали с J-цепью, меченной пероксидазой, затем переносили в планшеты, содержащие МкАт-1. После получасовой инкубации выявляли связанную с планшетом пероксидазу. Второй вариант ИФА отличался тем, что МкАт-1 иммобилизовали на твердой фазе посредством адсорбированных в лунках планшетов кроличьих антител против мышиных ig, что позволяло исследовать МкАт в составе культуральных жидкостей. В обоих вариантах постановки опыта топографическая сближенность распознаваемых МкАт-1 и МкАт-2 эпитопов приводила к снижению связывания меченого антигена на твердой фазе, к снижению оптической плотности.
Электрофорез и иммуноблотинг. Способность МкАт выявлять J-цепь в pig человека и животных оценивали после электрофорети-ческого разделения восстановленных кипячением в присутствии 2-меркаптоэтанола сывороток крови в 11%-м полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ПА-АГ-ДСН). Разделенные белки полусухим способом переносили из геля на мембрану PVDFimmobilon (Millipore), которую инкубировали с раствором МкАт, затем с перокси-дазным конъюгатом кроличьих антимышиных антител. Активность фермента выявляли инкубацией в растворе 1-хлор-4-нафтола (Sigma) с перекисью водорода. Для исследования сывороток крови крыс и мышей использовали конъюгат МкАт с пероксидазой. Для блокирования неспе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.