научная статья по теме МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ С РАЗЛИЧНЫМИ УРОВНЯМИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА 12-АЦИЛ-ЛИПИДНОЙ ДЕСАТУРАЗЫ Биология

Текст научной статьи на тему «МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ С РАЗЛИЧНЫМИ УРОВНЯМИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА 12-АЦИЛ-ЛИПИДНОЙ ДЕСАТУРАЗЫ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 581.1

МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ С РАЗЛИЧНЫМИ УРОВНЯМИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА А12-АЦИЛ-ЛИПИДНОЙ ДЕСАТУРАЗЫ

© 2014 г. Н. В. Загоскина, Е. В. Прядехина, П. В. Лапшин, Н. О. Юрьева, И. В. Голденкова-Павлова

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, 127276 Москва, ул. Ботаническая, 35

E-mail: phenolic@ippras.ru Поступила в редакцию 09.08.2013 г.

Исследованы морфофизиологические и биохимические характеристики контрольных и трансформированных геном Д12-ацил-липидной десатуразы (desA) растений картофеля (Solanum tuberosum L.) сорта Скороплодный, длительно выращиваемых в условиях in vitro. Установлено, что для трансформантов характерны более быстрый рост и переход к завершающим фазам онтогенеза по сравнению с контролем, которые сопровождались изменениями в накоплении фотосинтетических пигментов (хло-рофиллов a и b, каротиноидов) и фенольных соединений, в том числе флавоноидов, в листьях растений. Отмечено, что в большей степени они были выражены у трансгенной линии II, характеризующейся высоким уровнем экспрессии гена desA, тогда как линия I (средний уровень экспрессии) по многим параметрам близка к контрольному варианту.

DOI: 10.7868/S000233291402012X

Одно из активно развивающихся направлений современной биологии — генетическая инженерия растений, позволяющая переносить гены, изменяющие их свойства, в том числе устойчивость и продуктивность (Лутова, 2000; Shinozaki et al., 2003; Вячеславова и др., 2012). Такой подход успешно используется, в частности, при работе с сельскохозяйственными культурами промышленного назначения, к числу которых относится картофель. В настоящее время получены его трансгенные формы с повышенной устойчиво -стью к грибным патогенам, вирусам, колорадскому жуку и другим стрессорам, например действию низких температур, которому подвергаются многие растения в процессе своего развития (Кравец и др., 1992; Ляпкова и др., 2001; Douches et al., 2002; Трунова, 2007).

К возможным способам повышения устойчивости растений к гипотермии относятся перенос и экспрессия в них генов десатураз —ферментов, катализирующих превращение одинарной связи между атомами углерода в ацильных цепях жирных кислот в двойные (Los et al., 2013). При этом изменяется состояние мембран за счет увеличения содержания ненасыщенных жирных кислот в составе липидов, что приводит к повышению их "текучести" (Лось, 1977; Upchurch, 2008). Следует также отметить, что десатуразам свойственна специфичность действия. Так, Д9-ацил-липидная де-сатураза формирует первую двойную связь в молекулах жирных кислот, тогда как Д12-ацил-ли-

пидная десатураза — вторую (Лось, 1977; Chi et al., 2011; Los et al., 2013).

Введение десатураз вызывает изменения не только в составе синтезируемых в клетках жирных кислот, но и в накоплении липидов. В частности, в растениях картофеля сорта Десница, трансформированных геном Д12-ацил-липидной десатуразы (desA), увеличивалось содержание ли-нолевой и линоленовой кислот в мембранных ли-пидах листьев, возрастали общее содержание жирных кислот и их индекс ненасыщенности, а также повышалась устойчивость к окислительному стрессу и гипотермии (Маали и др., 2007; Демин и др., 2008). При этом у трансформированных растений был отмечен и более низкий по сравнению с контролем уровень перекисного окисления липидов, что свидетельствует об изменениях в "работе" их антиоксидантной системы. Поэтому большой интерес вызывают фенольные соединения (или полифенолы) — низкомолекулярные компоненты антиоксидантной системы растений (Blokhina et al., 2003; Меньщикова и др., 2006; Rafat et al., 2010). Эти вещества относятся к одним из наиболее распространенных в растительных клетках вторичных метаболитов (Запро-метов, 1993; Bidel et al., 2010). Предполагают, что полифенолы способны инактивировать свободные радикалы, защищая клетки растений от активных форм кислорода (Запрометов, 1993; Lin et al., 2002; Меньщикова и др., 2006).

Один из основных и важных метаболических процессов — фотосинтез, обеспечивающей растительные клетки субстратами и энергией (Мокро-носов, 1981). Для оценки фотосинтетической активности достаточно часто используют такие биохимические показатели, как содержание хло-рофиллов а и b в листьях, их соотношение, а также содержание каротиноидов (Андрианова, Тар-чевский, 2000). На основе этих данных можно быстро охарактеризовать как физиологическое состояние, так и метаболический потенциал растений (Романова и др., 2011).

К началу наших исследований уже имелись сведения о трансформации растений картофеля генами десатураз, в том числе и des A (Демин и др., 2008; Герасименко и др., 2010; Астахова и др., 2011). В то же время характер их роста в течение длительного культивирования в условиях in vitro был мало изучен, так же как и особенности накопления различных фотосинтетических пигментов и фенольных соединений, что важно для понимания физиологии трансгенных растений.

Цель работы — сравнение морфофизиологиче-ских характеристик контрольных (нетрансфор-мированных) и трансформированных геном desA растений картофеля, а также содержания в их листьях различных пигментов и фенольных соединений. При этом мы использовали две линии трансформантов, которые, как показали данные предыдущих исследований, имели разный уровень экспрессии этого гена (Шимшилашвили, 2010). Такой подход позволит выяснить, во-первых, влияет ли "встройка" гена desA на рост, онтогенез и биохимические характеристики растений, в частности образование пигментов и полифенолов, а во-вторых, зависят ли они от уровня его экспрессии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования были культивируемые в условиях in vitro растения картофеля (Solanum tuberosum L., раннеспелый сорт Скороплодный). Для получения трансгенных линий использовали конструкции, несущие ген desA из цианобакте-рии Synechocystis sp. PCC 6803 под контролем сильного конститутивного промотора 35S РНК CaMV. Последовательность гена десатуразы была трансляционно слита с последовательностью ре-портерного гена licBM3, кодирующего термостабильную лихеназу. Экспрессия целевого гена была подтверждена результатами полимеразной цепной реакции, а уровень экспрессии был оценен по активности лихеназы, входящей в состав гибридного белка (Герасименко и др., 2010). Трансгенные линии имели средний (линия I) или высокий (линия II) уровни экспрессии гена desA. Контролем служили нетрансформированные растения.

Растения выращивали в пробирках на агаризо-ванной питательной среде Мурасиге и Скуга, содержавшей 2% сахарозы, при 24°С и 16-часовом фотопериоде (люминесцентные лампы белого света ЛБ-80, освещенность 100 мкмоль кван-тов/(м2 с) в камере фитотрона ИФР РАН. Для исследований использовали растения в возрасте 30, 60 и 90 сут.

Морфофизиологическое состояние растений оценивали по их высоте, числу междоузлий, развитию корневой системы, формированию клубней. Определяли также сырой вес растений и отделенных от них листьев.

Содержания хлорофиллов (a и b) и каротиноидов определяли спектрофотометрическим методом после экстракции высечек из листьев растений 96%-ным этанолом (Шлык, 1971).

Содержание суммы растворимых фенольных соединений и флавоноидов определяли спектрофотометрическим методом с реактивом Фолина— Дениса и с 1%-ным водным раствором хлористого алюминия соответственно (Gage, Wendei, 1950; Запрометов, 1971) после их извлечения из свежих листьев 70%-ным этанолом. Калибровочные кривые в обоих случаях строили по рутину.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica for Windows и графопостроителя Microsoft Office Excel 2007. В экспериментах использовали трехкратные биологические и аналитические повторности измерений. В таблицах и на рисунках представлены средние арифметические значения определений и их стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Поскольку до сих пор нет ясности в вопросе о влиянии "чужеродных" для растительных клеток генов на физиологические и биохимические характеристики высших растений, то интересно было сравнить основные физиолого-биохимиче-ские параметры контрольных растений картофеля и полученных из них трансформантов с различными уровнями экспрессии гена desA из ци-анобактерии Synechocystis sp. PCC 6803.

Морфофизиологические характеристики растений. Растения картофеля и полученные из них трансгенные линии со средним или высоким уровнями экспрессии гена desA отличались по морфофизиологическим характеристикам (рис. 1, табл. 1). Для трансформантов характерны более быстрые рост и переход к завершающим фазам онтогенеза по сравнению с контролем. Наиболее ярко это проявлялось у растений линии II, у которых уже к 30-м сут культивирования высота достигала практически максимальных значений. При дальнейшем их культивировании (60 и 90 сут) увеличение биомассы было незначительным. Расте-

ния линии I с более низким уровнем экспрессии гена desA росли в течение всего периода культивирования, но более интенсивно до 30 сут. Прирост биомассы у них был выше, чем у растений линии II (особенно до 60 сут). В обеих трансгенных линиях отмечалось пожелтение нижних листьев к 90-м сут выращивания, а также формирование клубней (у линии II уже к 60-м сут роста), что свидетельствует о переходе растений к завершающим этапам онтогенеза.

У контрольных (нетрансформированных) растений до 60-х сут культивирования отмечались почти вдвое меньшие значения высоты и массы по сравнению с таковыми у транс формантов. К 90-м сут выращивания по некоторым морфофи-зиологическим характеристикам (число междоузлий, вес растения и др.) они приближались к трансгенным растениям линии I и даже превышали таковые у растений линии II, хотя формирования клубней у них не наблюдалось.

Исходя из полученных данных можно предположить, что введение гена desA в растения картофеля сорта Скороплодный ускоряло их развитие, что в большей степени проявлялось у линии II. В исследовании Шимшилашвили (2010) также было показано, что при трансформации растений картофеля сорта Десница геном des A образование микроклубней начиналось раньше, чем у контрольных раст

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком