научная статья по теме МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАЛЛУСОВ ЯЧМЕНЯ, ТОЛЕРАНТНЫХ К ТОКСИЧЕСКОМУ ДЕЙСТВИЮ АЛЮМИНИЯ Биология

Текст научной статьи на тему «МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАЛЛУСОВ ЯЧМЕНЯ, ТОЛЕРАНТНЫХ К ТОКСИЧЕСКОМУ ДЕЙСТВИЮ АЛЮМИНИЯ»

УДК 581.17(06)+604.6:58(06)

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАЛЛУСОВ ЯЧМЕНЯ, ТОЛЕРАНТНЫХ К ТОКСИЧЕСКОМУ ДЕЙСТВИЮ АЛЮМИНИЯ

© 2015 г. Е. Н. Баранова1*, И. А. Чабан1, Н. В. Кононенко1, О. Н. Шуплецова2,

1,4

И. Г. Широких2 3, |В. Ю. Поляков!1

всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, 127550, Москва, Тимирязевская ул., 42; *электронная почта: greenpro2007@rambler.ru 2Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого, 610007, Киров, ул. Ленина, 166а; электронная почта: irgenal@mail.ru 3Институт биологии Коми НЦ УрО РАН и ВятГГУ, лаборатория биомониторинга, 610002, Киров, ул. Красноармейская, 26 4Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Поступила в редакцию 17.09.2014 г. После доработки 21.01.2015 г.

C использованием методов световой микроскопии и цитофотометрии ДНК проведен сравнительный анализ структурной организации каллусов гибридной линии ячменя Дуэт х Биос, выращенных в стандартных условиях культивирования и на средах, содержащих ионы алюминия (20 и 40 мг/л). В морфогенных каллусах, растущих на среде без алюминия, идентифицировано три основных типа клеток: меристематиче-ские, дифференцированные и гибнущие. Меристематические клетки формируют морфогенные зоны, характерным признаком дифференцированных клеток является прогрессирующее накопление вакуолей с запасными веществами. В каллусах, выживающих в присутствии алюминия, отсутствуют структурно обособленные зоны меристематических клеток, резко снижается количество дифференцированных клеток с запасными веществами и возрастает количество гибнущих клеток. По данным цитофотометрии изменение морфологического статуса устойчивых каллусов сопровождается частичным подавлением пролиферации, накоплением клеток в постсинтетической фазе клеточного цикла и полиплоидизацией, по-видимому, вызванной эндоредупликацией ДНК. Принципиально важно, что устойчивые к токсическому действию алюминия каллусы обладают высокой способностью к регенерации: доля морфогенетически активных каллусов, выживших в среде с алюминием (40 мг/л) примерно в 5 раз превосходит долю морфогенных каллусов в контроле. Для выявления клеточных мишеней токсического действия алюминия в сформированных тканях изучены корешки ризогенных каллусов. С этой целью использовали каллусы, полученные от растений, толерантных к токсическому действию алюминия (сорт Купец), чувствительной линия 999-93 и полученной методом клеточной селекции линии, устойчивой к действию алюминия линия 917-1. Оказалось, что в растущих корнях каллусов, полученных от неустойчивых линий, алюминий индуцирует гибель дифференцированных клеток эпидермиса и проводящей системы, тогда как недифференцированные клетки меристемы остаются интактными. В противоположность этому ризогенные каллусы, полученные от устойчивых форм, дают нормальные корешки. Это наблюдение имеет важное прогностическое значение, так как позволяет отбирать устойчивые к алюминию регенеранты на ранних этапах клеточной селекции. Полученные данные позволяют высказать предположение, что появление устойчивых линий обусловлено, по-видимому, сомаклональной изменчивостью, индуцированной высокими концентрациями селективного агента. Такого рода изменчивость возникает в системе in vitro в условиях стресса, в результате активации таких эпигенетических факторов, как, например, метилирование ДНК или ацетили-рование белков хроматина.

Ключевые слова: каллус, ячмень, регенерация, токсичность алюминия.

Б01: 10.7868/80233475515030032

ВВЕДЕНИЕ

Алюминий — один из наиболее распространенных элементов земной коры, существует в почвах в виде стабильных комплексов с кислородом (оксиды алюминия) и кремнием (алюмоси-

ликаты). В кислых почвах (рН 5 и ниже) алюминий солюбилизируется в почвенном растворе и адсорбируется корневой системой растений. При этом именно корневая система служит первоначальной мишенью токсического действия алю-

миния [1]. Прямое следствие патологии корневой системы — структурно-функциональные изменения в элементах побега и прежде всего в листьях: уменьшается фотосинтетическая активность тканей листа и появляются очаги некроза в листовой паренхиме, что резко снижает продуктивность и, в конечном итоге, может приводить к гибели растения [2].

На клеточном уровне потенциальными мишенями токсического действия алюминия являются клеточные стенки и плазматические мембраны [3], ядерная ДНК [4], ядрышки [5] и цитоскелет [б]. К повышенному содержанию солюбилизиро-ванного алюминия особенно чувствительны такие экономически важные культуры, как озимая пшеница, ячмень, гречиха, сахарная свекла, горох, лен, клевер, люцерна.

По этой причине создание сортов хозяйственно важных растений, устойчивых к действию алюминия, считается приоритетной задачей современной сельскохозяйственной биотехнологии. Одним из перспективных подходов является клеточная селекция, которая позволяет создавать в системе in vitro исходный материал, устойчивый к различным селективным факторам [7, 8], в том числе к алюминию [9—11]. Клеточная селекция позволяет значительно расширить спектр наследственной изменчивости за счет сомаклональных изменений, возникающих при культивировании изолированной ткани в результате мутаций, эпигенетической регуляции экспрессии генов, соматического кроссинговера и т.д. [7]. В то же время одна из актуальных и нерешенных проблем клеточной селекции состоит в том, что признаки, по которым можно надежно идентифицировать устойчивые к алюминию генотипы в системе in vitro, мало изучены. Именно по этой причине решающее значение имеет разработка цитологических критериев, позволяющих проводить сравнительную оценку исходных сортов и полученных на их основе линий в селективных системах с алюминием.

Цель настоящей работы — изучение действия алюминия на пролиферирующую каллусную ткань различных сортов ячменя.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение и культивирование каллусной культуры ячменя. В качестве эксплантатов для инициации каллусной ткани использовали незрелые зародыши гибридной линии ячменя (Hordeum vulgare L.) Дуэт х Биос, полученной из лаборатории селекции и первичного семеноводства ячменя НИИСХ Северо-Востока. Зародыши выделяли через 12—17 сут после опыления на третьей стадии дифференцировки, когда их длина достигала 1.5—2 мм [12].

Культивирование осуществляли в три этапа:

На первом этапе незрелые зародыши помещали на модифицированную среду Мурасиге-Скуга (МС) [13] с добавлением сахарозы (25 г/л), ди-хлорфеноксиуксусной кислоты (2,4D) (2 мг/л) и агар-агара (7 г/л), рН 5.6—5.8. Длительность первого этапа культивирования составляла 15—20 сут.

На втором этапе (этап пролиферации) полученные каллусы разделяли на две группы — контрольную и экспериментальную.

Контрольные образцы пассировали на модифицированную среду МС со сниженным до 1 мг/л содержанием 2,4D.

В условиях эксперимента для отбора линий, устойчивых к действию алюминия, использовали подкисленную среду МС (рН 4.0), содержащую сульфат алюминия. Количество Al2(SO4)3 подбирали таким образом, чтобы обеспечить концентрацию ионов А13+, для большинства генотипов ячменя, близкую к летальной — 40 мг/л (жесткий отбор) или снижающую среднюю выживаемость каллуса вдвое по сравнению с контролем — 20 мг/л (мягкий отбор) [11]. Длительность второго этапа культивирования — 21 сут.

На третьем этапе контрольные и экспериментальные образцы морфогенного каллуса пересаживали на модифицированную среду, не содержащую А13+ (среда МС с добавлением 1 мг/л ки-нетина, 0,5 мг/л Р-индолилуксусной кислоты и 0.1 мг/л гибберелловой кислоты). Каллус выращивали при температуре 20—24°С, с 16-часовым фотопериодом и освещенности 8 клк.

Растения-регенеранты, полученные из каллусов, выросших в нормальной среде, и из каллусов, выживших в селективных условиях, высаживали в вегетационные сосуды, наполненные смесью из почвы, песка и торфа в равных объемах, и выращивали для получения семенного потомства в климатической камере фирмы Ilka (Германия) со следующим режимом: температура днем 20— 22°С, ночью 16—18°С, фотопериод 16 ч. По окончании вегетации определяли структуру урожая каждого регенерировавшего растения.

Микроскопия. От каллуса отделяли фрагменты размером около 2—4 мм, фиксировали 2.5% раствором глутарового альдегида (Merck, Германия) на 0.1 М фосфатном буфере Серенсена (рН 7.2) с добавлением 1.5% сахарозы в течение 2 ч. После отмывки от фиксирующей смеси материал помещали в 1% раствор четырехокиси осмия (0s04) на 0.1 М фосфатном буфере Серенсена (рН 7.2) на 1.5—2 ч, затем образцы обезвоживали в серии растворов этанола повышающейся концентрации (30, 50, 70, 96 и 100%). Полученные образцы обрабатывали окисью пропилена (Fluka, Германия) и заключали в эпоксидную смолу (смесь Эпон-812 и Аралдита, Merck, Германия) по стандартной ме-

Таблица 1. Влияние ионов алюминия на выживаемость и морфогенез каллусной культуры ячменя Дуэт х Биос

Концентрация Al3+, мг/л Количество пассированных каллусов, шт. Количество выживших каллусов

рН общее из них морфогенные

шт. % шт. %

6.0 0 38 38 100 4 10.5

4.0 20 40 32 46 22 15 68.9 32.6 8 8 36.3 53.3

тодике. Из заливочных блоков приготавливали полутонкие (1—2 мкм) срезы с помощью ультрамикротома LKB—V (LKB, Швеция).

Срезы монтировали на предметные стекла, окрашивали 0.1% водным раствором метиленово-го синего (Merck, Германия) и заключали в эпоксидную смолу. Препараты анализировали и фотографировали с помощью микроскопа Axiovert 200 М (Carl Zeiss, Германия), оборудованного камерой AxioCamHRm (Carl Zeiss, Германия).

Цитофотометрия. Фрагменты каллуса размером около 2—4 мм фиксировали в смеси этанола и уксусной кислоты (в соотношении 3 : 1) в течение 3 ч. Мацерацию каллуса проводили в растворе, содержащем 0.4% целлюлазы (Sigma, США) и 0.4% пектиназы (Merk) в течение 2 ч при температуре 37°C. После гидролиза в 5 н. HCl (40 мин при 22°C) суспензию клеток окрашивали реактивом Шиффа (Merk) в течение 2 ч. Содержание ДНК в ядрах измеряли на цитофотометре SMP-20 (Op-ton)

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»