ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 5, с. 739-749
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 581.1
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКИ ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ КОРНЕЙ ШЛЕМНИКА
АНДРАХНОВИДНОГО © 2014 г. И. Н. Кузовкина*, М. Ю. Прокофьева*, А. Р. Умралина**, Т. П. Чернышева**
*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва **Институт биотехнологии Национальной академии наук Киргизской Республики, Бишкек
Поступила в редакцию 01.10.2013 г.
Впервые введены в культуру in vitro генетически трансформированные корни (hairy roots) и каллу-сная ткань шлемника андрахновидного (Scutellaria andrachnoides Vved.) — эндемичного растения Киргизской Республики. Для полученных культур характерен интенсивный и стабильный рост в жидкой питательной среде Гамборга, не содержащей гормонов. При этом недифференцированно растущая каллусная культура опережала по интенсивности роста hairy roots, от которых она была получена. Исследован состав вторичных метаболитов hairy roots, каллусной ткани, а также корней проростков и многолетних растений S. andrachnoides. Установлено, что hairy roots и каллусная культура S. andrachnoides сохраняли способность к синтезу флавонов, типичных для корней интактных растений. Обнаружены существенные различия в количественном составе вторичных соединений корней ювенильных и многолетних растений. Для корней проростков, не имеющих, как и hairy roots, вторичного утолщения, характерно преобладание в составе флавонов вогонозида, глюкуронида во-гонина, в то время как в корнях многолетнего растения, обладающих способностью к росту за счет вторичного утолщения, доминирующим флавоном является байкалин — глюкуронид байкалеина. Предлагается использовать крупномасштабное культивирование в условиях in vitro корней и особенно быстро растущей каллусной ткани S. andrachnoides с выгодным содержанием только одной группы флавонов для разработки биотехнологического способа получения вогонина и создания на его основе нового препарата - ценного противоопухолевого средства растительного происхождения с селективной цитотоксической активностью.
Ключевые слова: Scutellaria andrachnoides - hairy roots - флавоны - байкалеин - байкалин - вогонин - во-гонозид - фенилэтаноиды - актеозид - вторичный метаболизм in vitro
DOI: 10.7868/S0015330314040113
ВВЕДЕНИЕ
Шлемник андрахновидный (Scutellaria andrachnoides Vved.) является одним из представителей рода Scutellaria (сем. Lamiaceae), насчитывающего около 360 видов растений. Этот вид шлемника был определен А.И. Введенским и включен в 1954 г. в каталог Флоры растений СССР как редкий вид, произрастающий в Киргизии [1]. Ареал распространения шлемника андрахновидного очень ограничен. Растение встречается на каменистых склонах скал Атойнокского и Ферганского хребтов на высоте 900-1600 м над уровнем моря и относится в силу своей малочисленности к числу эндемичных растений, включенных не
Адрес для корреспонденции: Кузовкина Инна Николаевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: ikuz@mail.ru
только в международный перечень редких видов лекарственных растений [2], но и в Красную книгу эндемичных растений Киргизской Республики [3]. Сведения о культивировании этого растения отсутствуют. 8. andrachnoides - многолетнее невысокое растение с белыми, пятнисто-фиолетовыми венчиками декоративных цветов характерного для растений сем. Яснотковых (Губоцветных) строения, которое цветет в мае-июне, а плодоносит в июле. Химический состав вторичных метаболитов шлемника андрахновидного не изучен из-за его редкой встречаемости и произрастания в мало доступных гористых районах Киргизии [3]. Именно поэтому это растение не вошло в перечень других видов шлемников, у которых был обстоятельно исследован состав вторичных соединений, содержащихся в корнях и надземной части [4]. Редкая встречаемость растения и полное отсутствие данных о химическом составе вторич-
739
9*
ных веществ, локализованных в его органах и особенно в подземной части растения, послужили предпосылкой для введения в культуру in vitro генетически трансформированных корней шлемника андрахновидного и изучения их способности к синтезу корнеспецифичных для всех видов шлемников флавоноидов — флавонов и фенил-этаноидов, обладающих высокой физиологической активностью [5, 6].
Цель настоящей работы состояла в изучении особенностей роста корней S. andrachnoides, культивируемых в условиях in vitro, и в сопоставлении качественного и количественного состава вторичных метаболитов, которые синтезируются в генетически трансформированных корнях и в корнях целых растений, причем не только многолетних, но и ювенильных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Введение в культуру in vitro генетически трансформированных корней шлемника. Для получения стерильных проростков шлемника андрахновид-ного (Scutellaria andrachnoides Vved.) были использованы семена, собранные во время экспедиции, проведенной летом 2005 г. в районе горы Тахта-лык Ферганского хребта. Стратифицированные семена после их обезжиривания 96% этанолом стерилизовали раствором диоцида в течение 15 мин, после чего многократно промывали стерильной водой и переносили для проращивания в чашки Петри на модифицированную питательную среду Стрита [7]. После прорастания семян стерильные проростки переносили в чашки Петри со свежей средой Стрита, которые помещали в камеру с освещением.
Для генетической трансформации проростков S. andrachnoides использовали семядоли и фрагменты гипокотилей, которые отделяли в стерильных условиях от 3-недельных ювенильных растений. Для трансформации использовали дикий штамм 15834 почвенной агробактерии Agrobacte-rium rhizogenes. Трансформацию проводили по методике, изложенной в ранее опубликованной статье [8]. Часть полученных и типичных по своей морфологии генетически трансформированных корней (так называемых hairy roots) S. andrachnoides переводили после второго пассажа в жидкую питательную среду В5 [9], в то время как остальную часть корней продолжали культивировать в условиях поверхностной культуры, на ага-ризованной среде того же состава. В конце третьего пассажа в условиях погруженной культуры на корнях начали проявляться признаки недифференцированного роста корневых окончаний в виде каллусов небольшого размера, которые по мере роста сливались в достаточно крупные недифференцированно растущие образования. Попытка стабилизации обычного роста корней с по-
мощью введения в питательную среду ИМК (0.5 мл/л) была безрезультатна, и каллусогенез полученной корневой культуры продолжался. При перенесении массы образовавшегося каллуса (около 2 г сырого веса) в 100 мл жидкой среды В5, не содержавшей ростовые вещества, была получена суспензионно-каллусная культура S. andrachnoides корневого происхождения, которая стабильно растет в условиях in vitro уже в течение 7 лет.
При двухлетнем культивировании другой части корней, полученных при трансформации и выращиваемых в условиях постоянной поверхностной культуры, не было отмечено признаков недифференцированного роста, и экспланты сохраняли морфологические признаки изолированно растущей корневой культуры. Перевод таких корней в жидкую питательную среду В5, после их более чем двухлетнего культивирования на агаризованной питательной среде того же состава, не вызвал изменений в характере роста корневой культуры и она сохранила морфологические признаки, типичные для hairy roots (быстрый рост, интенсивное ветвление и плагиотропный рост корневых окончаний).
Таким образом, в результате проведения генетической трансформации стерильных проростков шлемника андрахновидного были получены две линии корневой культуры — одна с сохранением морфологических признаков, характерных для hairy root culture, другая — с перерождением корней в интенсивно растущую суспензионно-каллусную культуру. Обе культуры послужили объектами исследования при проведении настоящей работы. При анализе состава вторичных соединений у полученных культур (каллусной и корневой) в качестве контроля были использованы также корни ювенильных растений S. andrachnoides, выращенные в условиях in vitro, а также корни взрослых, многолетних растений, собранных во время экспедиции.
Условия культивирования и определение параметров роста. Для поддержания роста двух полученных культур — каллусной и корневой - использовали одинаковые условия: культивирование в жидкой безгормональной среде В5 (с 2% сахарозы) на качалке (90 об./мин) в темноте при температуре 25-26°С. Длительность культивирования корней и каллусной культуры в течение пассажа составляла 4 нед. Инокуляты при пересадках имели около 2 г сырого веса на 100 мл питательной среды для каллусной культуры и около 1 г сырого веса на 40 мл среды для корневой культуры. В дальнейшем с целью получения большей массы корневой культуры шлемника перешли на ее пролонгированное выращивание, которое заключалось в переведении корневых эксплантов после 3 нед. их роста в 100-миллилитровых колбах с 40 мл питательной среды в колбы объемом
300 мл, содержавших по 100 мл питательной среды, и продолжали их дополнительное культивирование в течение 4 нед. При этом в конце 3-й недели роста корневых культур в колбах большего объема добавляли порции свежей питательной среды (30-50 мл на колбу), что в итоге продлило длительность пассажа hairy roots до 7 нед. и обеспечило получение увеличенной массы корней.
В конце пассажа корневой и каллусной культур определяли свежий вес конечных эксплантов, предварительно поместив их на бумажный фильтр в воронку Бюхнера и удалив избыток питательной среды при небольшом вакууме в колбе Бунзена. Затем культуры замораживали при -20°С, высушивали с помощью лиофилизации, после чего определяли их сухой вес и рассчитывали соответствующий для каждой культуры ростовой индекс (РИ), а также содержание сухого вещества в растительной массе (%). Помимо ростовых показателей корней и каллусной ткани оценивали состояние питательной среды, в которой росли культуры, для чего определяли рН среды и ее электропроводность в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.