ЗООЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, том 88, № 2, с. 131-142
УДК 576.895.132
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРИО-ТАКСОИОМИЧЕСКИЕ РАЗЛИЧИЯ ДВУХ ВИДОВ РОДА HAMMERSCHMIDTIELLA CHITWOOD 1932 (NEMATODA, OXYURIDA, THELASTOMATIDAE)
© 2009 г. Е. А. Гузеева1' 2, С. Э. Спиридонов2
биологический факультет Московского государственного университета, Москва 119991, Россия
e-mail: guzeyeva@mail.ru
2Центр паразитологии, Институт проблем экологии и эволюции РАН, Москва 119071, Россия
e-mail: s_e_spiridonov@rambler.ru Поступила в редакцию 24.01.2008 г.
Приведены результаты изучения нематод-теластоматид вида Hammerschmidtiella cristata Spiridonov 1984, обитающих в заднем отделе кишечника мадагаскарских тараканов Gromphadorhina portentosa (Schaum), с использованием светового и сканирующего электронных микроскопов (СЭМ). Полученные данные подтвердили наличие гребневидной кутикулярной структуры на передней губе клоаки самцов, что является признаком, отличающим этот вид от остальных видов данного рода. Выявлен ряд дополнительных признаков, позволяющих надежно дифференцировать его: строение кутикулы переднего конца тела и пищевода самок, оболочек яиц. Получены и проанализированы данные по Б2Б3-сегменту последовательности большой субъединицы рибосомы для двух видов Hammerschmidtiella - H. cristata и H. diesingi (Hammerschmidt 1838) Chitwood 1932, а также для тела-стоматид родов Leidynema, Cranifera и Severianoia. Показано, что уровень молекулярно-таксономи-ческих различий между двумя видами хаммершмидтиелл достаточно высок - 74 пары нуклеотидов (т.е. более 10% от общей длины сравниваемых участков рибосомальной ДНК). Анализ совокупных морфологических и молекулярно-таксономических данных подтверждает обоснованность выделения нематод из мадагаскарских тараканов-громфадорин в отдельный вид H. cristata. Дополнено описание этого вида, из образцов типовой серии выделен лектотип.
Нематоды семейства Thelastomatidae населяют кишечник различных насекомых (тараканов, прямокрылых, пластинчатоусых жуков, жуков-водолюбов, личинок двукрылых), а также многоножек и дождевых червей (Adamson, 1989; Spiridonov, Ivanova, 1998; Спиридонов, 2002). Теластоматиды являются обитателями пищеварительной системы беспозвоночных, для которых характерна богатая бактериальная флора, участвующая в ферментации пищи (Филипьев, 1934; Спиридонов, 1998). В таксономическом отношении эти нематоды разнообразны: в составе семейства несколько десятков родов, морфологически значительно отличающихся друг от друга. Видовая систематика разработана достаточно слабо - ощущается дефицит признаков, необходимых для межвидовой диагностики. Актуальным становится применение молекулярных методов (сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей).
В 1978-1979 гг. Спиридонов описал два новых вида данного семейства из кишечника мадагаскарских тараканов Gromphadorhina portentosa (Schaum) из инсектария Московского зоопарка. Несмотря на то, что насекомые к тому времени уже более 40 лет содержались в культуре, вне связи с первичными местами их обитания, в задней
кишке были найдены представители двух неизвестных видов из родов Hammerschmidtiella Chit-wood 1932 и Leidynema Schwenk 1929. Это таксономическое сообщение было сдано в "Зоологический журнал", однако в 1980 г. (до выхода публикации) стало известно, что один из двух новых видов уже обнаружен у тараканов с о-ва Мадагаскар и описан как Leidynema portentosae Ван Веребеке (Van Waerebeke, 1978). В связи с этим статья была отозвана из печати, и вид рода Hammerschmidtiella остался неописанным. Его краткая характеристика, сопровождающаяся рисунком, появилась в Трудах Зоологического института АН СССР в 1984 г. (Спиридонов, 1984). Выделение нового вида основывалось на уникальном для данного рода признаке - наличии гребневидного кутикулярного образования на передней губе клоаки самцов. Отсюда и было предложено название - Hammerschmidtiella cristata Spiridonov 1984, т.е. хаммершмидтиеллы, несущие гребень. Однако это описание было неполным, что справедливо отметил Джекс и др. (Jex et al., 2005).
С возобновлением работы по теластоматидам беспозвоночных в Лаборатории фауны и систематики паразитов Центра паразитологии ИПЭЭ
РАН представилось возможным провести подробное исследование этого вида и дополнить его морфологическую характеристику данными сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Кроме того, были получены нуклеотидные последовательности рибосомальной ДНК как изучаемого, так и типового вида рода Hammer-schmidtiella diesingi (Hammerschmidt 1838) Chit-wood 1932 и видов теластоматид трех родов (Cranifera, Leidynema и Severianoia). Ниже приводится описание H. cristata и обсуждается роль таксономических признаков, основанных на данных тонкой морфологии поверхности тела и нуклео-тидных последовательностях большой субъединицы рибосомы в систематике представителей семейства Thelastomatidae.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Сбор материала для изучения методами световой микроскопии. Из брюшной полости извлекали кишечник и по границе мальпигиевых сосудов отделяли заднюю кишку. Необходимый для дальнейшего исследования фрагмент помещали в 0.9% физиологический раствор, разрывали и вычищали его с помощью препаровальных игл. Нематод переносили на часовое стекло с физиологическим раствором и выдерживали над пламенем горелки до момента выпрямления их тела. Собранных червей переносили в раствор Зайнхорста (Seinhorst, 1959) и оставляли в термостате при температуре 37°C до полного выпаривания воды и спирта. Затем изготовляли постоянные препараты в глицерине с окантовкой из парафина.
Для морфологического описания исследуемых нематод использованы сокращения: L - общая длина тела; a - отношение длины к максимальному диаметру тела; b - отношение длины тела к длине пищевода; c - отношение длины тела к длине хвоста; V, % - отношение расстояния до вульвы к общей длине тела; V', % - отношение расстояния до вульвы к длине тела без учета длины хвоста; n - общее количество особей нематод.
Сбор материала для изучения методами сканирующей микроскопии. Для исследования поверхностных структур кутикулы, нематод, предварительно фиксированных нагреванием, проводили в серии спиртов (смена растворов с повышающейся концентрацией - 10, 20, 40, 60, 80 и 96%) с последующим обезвоживанием ацетоном. Объекты высушивали методом "критической точки" в аппарате HCP-2 HITACHI, монтировали на микроскопные столики-подложки и напыляли золотом в вакуумной установке BIO-RAD SC502. Образцы изучали, используя микроскоп JSM-6380 LA, в Лаборатории электронной микроскопии Биологического факультета МГУ.
Сбор материала для проведения молекулярно-таксономического исследования. ДНК выделяли из одиночных особей теластоматид с использованием лизирую-щего буфера. Для этого фрагменты нематод переносили в 8 мкл раствора буфера (500 мМ KCl, 100 мМ TrisHCl при pH 8.3, 15 мМ MgCl2, 10 мМ дитиотрейтол, 4.5% Tween 20, 0.1% желатин). После замораживания (-70°C в течение 1 ч) добавляли 10 мкл дистиллированной воды и 2 мкл проте-иназы K и инкубировали 1 ч при 65°C и 10 мин при 95°C.
Суспензию центрифугировали в течение 1 мин при 13000 об/мин. От 2 до 4 мкл данной суспензии использовали в качестве пробы для ПЦР. Состав ПЦР-смеси готовили по прописи производителя (ЗАО "Силекс") (13.2 мкл H2O, 2 мкл 10х ПЦР-бу-фера, 3.2 мкл раствора dNTP, по 0.3 мкл каждого праймера, 0.2 мкл Taq).
Для амплификации участка рибосомальной последовательности большой субъединицы (D2D3 LSU rDNA) использовали праймеры D2A (ACA-AGT-ACC-GTG-AGG-GAA-AGT-TG) и D3B (TCG-GAA-GGA-ACC-AGC-TAC-TA). Параметры ПЦР-реакции: первичная денатурация -94°C, 5 мин; затем 34 цикла с одинаковыми параметрами (94°C, 60 с; 50°C, 60 с и 72°C, 60 с), после чего происходила финальная элонгация в течение 10 мин при 72°C. Продукты ПЦР-реакции выявляли в агарозном геле, вырезали и очищали с помощью набора "Qiagen® gel extraction and product cleaning kit". После лигации с вектором pGEM-T ПЦР-продукт использовали для трансформации компетентных клеток JM 109 Esherichia coli (по протоколу фирмы-производителя "Promega®"). Трансформированные колонии культивировали в 1.5 мл среды LB, инкубируя 16-22 ч при 37°C. Плазмидную ДНК выделяли из клеток E. coli с применением "QIAprep Miniprep Kit® for purification of plasmid DNA" в соответствии с инструкцией и использовали для секвенирования с помощью "BigDye® Termination Kit", добавляя по 3.2 пМ праймеров T7 и SP6 для вектора. Продукты реакции терминации осаждали этанолом, высушивали на воздухе и ресуспендировали в "ABI Prism® Template Suppression Reagent".
Полученные последовательности были депонированы в NCBI GenBank: Hammerschmidtiella diesingi (737 bp - число пар нуклеотидов) -EU365628, Hammerschmidtiella cristata (723 bp) -EU365629, Leidynema appendiculata (714 bp) -EU365630, Severianoia sp. (740 bp) - EU365631, Cranifera cranifera (744 bp) - EU365632.
Выравнивания получали с использованием программы Clustal X и анализировали в программе PAUP* 4.0b10 (Swofford, 1998).
Таблица 1. Морфометрические показатели Иаттегзскт1йПе11а сг1з1Ма
Показатель Лектотип, самец Паралектотипы
самцы, п = 15 самки, п = 11
Ь, мкм 610 622.3 ± 74.5 (530-775) 1967.3 ± 166.1 (1620-2250)
Максимальный диаметр, мкм 47.5 51.1 ± 8.6 (35-67.5) 163.5 ± 30.2 (120-230)
Длина пищевода, мкм 115 110.3 ± 6.2 (97.5-120) 334 ± 22.6 (300-378)
Расстояние до экскреторной поры, мкм 145 166.7 ± 22.7 (128-200) 401 ± 27.1 (355-420)
Расстояние до вульвы, мкм - - 623.3 ± 41.3 (580-690)
Длина спикулы, мкм 21 20.5 ± 1.3 (18-22) -
Длина хвоста, мкм 74 66.5 ± 7.8 (57-85) 548.6 ± 65.4 (450-660)
а 12.8 12.4 ± 1.6 (9.3-16.4) 12.3 ± 1.4 (9.8-13.9)
Ь 5.3 5.7 ± 0.6 (4.6-7.1) 5.9 ± 0.4 (5.1-6.4)
с 8.2 9.5 ± 1.6 (6.5-12.4) 3.6 ± 0.4 (3.1-4.3)
V, % - - 31.4 ± 1.3 (30.3-33.9)
Примечание. Значения всех измерений приведены в микрометрах. X ± 5, в скобках минимум и максимум.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Наттег$сЬ,т1ййв11а епъЬаЬа Бртёопоу 1984 (рис. 1; 2а-2г; табл. 1)
Материал. Лектотип в (глицериновый препарат № 1047, ЦП ИПЭЭ РАН), паралектотипы: 14 вв, 11 5 5.
Выделение лектотипа. Поскольку выделенный в 1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.