СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2007, том 21, № 2, с. 130-139
УДК 597.5+612.843.114
МОРФОЛОГИЯ ГАНГЛИОЗНЫХ КЛЕТОК СЕТЧАТКИ ЛЯГУШКИ RANA TEMPORARIA, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОМУ ОТДЕЛУ ДОБАВОЧНОЙ ЗРИТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЫ
© 2007 г. Т. А. Подугольникова, С. Л. Кондрашев1, И. И. Пущин1
Институт проблем передачи информации РАН 127994 Москва, Б. Каретный пер., 19
E-mail: tap@iitp.ru 1Институт биологии моря ДВО РАН 690041 Владивосток, ул. Палъчевского, 17 E-mail: slk49@mail.ru
Морфологию ганглиозных клеток (ГК) сетчатки лягушки Rana temporaria, проецирующихся в ба-зальное оптическое ядро (БОЯ) добавочной зрительной системы, исследовали по тотальным препаратам, окрашенным методом ретроградного аксонного транспорта пероксидазы хрена. Количественный анализ структуры ГК проводился с учетом таких показателей, как размер клеточного тела, размер дендритного поля, размах ветвления дендритов, суммарная длина терминальных дендритов и плотность дендритного ветвления. Все измерения делали по детальным рисункам, изготовленным с иммерсионным объективом (х100) при помощи рисовального аппарата. За редким исключением, тела ГК были расположены в слое ганглиозных клеток. Размеры клеточных тел в средней периферической зоне сетчатки варьировали от 112 до 335 мкм2 (средний размер равен 203 ± ± 58.7 мкм2). От тела клеток отходят 2-3 основных дендрита, которые несколько раз делятся, образуя большое однослойное дендритное ветвление (средняя площадь равна 0.13±0.05 мм2) в "а" подслое внутреннего синаптического слоя. Результаты сравнительного морфологического анализа показали, что дирекционально-чувствительные ГК, проецирующиеся в базальное оптическое ядро, имеют одинаковое строение и позволили установить корреляцию между их морфологией и функциональными свойствами не удалось.
Ключевые слова: сетчатка лягушки, центральные проекции, ганглиозные клетки, добавочная зрительная система, пероксидаза хрена.
ВВЕДЕНИЕ
Добавочная зрительная система (ДЗС) является одним из основных, филогенетически древних, первичных зрительных центров у позвоночных животных всех классов (рыбы: Finger, Karten, 1978; амфибии: Jakway, Riss, 1972; Toth et al., 1980; рептилии: Reiner, 1981; Montgomery et al., 1981; птицы: Karten et al., 1977; Fite et al., 1981; млекопитающие: Cooper, Magnin, 1987; Simpson, 1984; Zhang, Hoffmann, 1993, Giolli et al., 2006). Ядра ДЗС получают прямые входы преимущественно от ганглиозных клеток контралатеральной сетчатки (Подугольникова и др., 1991; Zhang, Eldred, 1994; Telkes et al., 2000). В электрофизиологических исследованиях показано, что у всех исследованных животных и ганглиозные клетки сетчатки, и центральные нейроны, принадлежащие ДЗС, имеют большие рецептивные поля, обладают дирекциональной чувствительностью к медленно движущимся крупным структурированным стимулам и представлены, по крайней мере, тремя функциональными подтипами с избиратель-
ной предпочтительностью к разным направлениям движения стимула: снизу вверх, сверху вниз и от головы к хвосту (амфибии: Cochran et al., 1984; Gruberg, Grasse, 1984; Бастаков и др., 1992; рептилии: Rosenberg, Ariel, 1991; Kogo et al., 1998; птицы: Wylie, Frost, 1990, Wolf-Oberhollenzer, Kirschfeld, 1994; млекопитающие: Oyster et al., 1980; Grasse, Cynader, 1984; Soodak, Simpson, 1988; Mus-tari, Fuchs, 1989).
Субпопуляция ганглиозных клеток, принадлежащих ДЗС, состоит из крупных или средних нейронов, образующих большие дендритные ветвления, распространяющиеся в определенном подслое ВСС. У черепахи, лягушки, хамелеона, голубя, цыпленка, кролика и кошки ганглиозные клетки моностратифицированные (Simpson, 1984; Подугольникова и др., 1991; Zang, Eldred, 1994. Bellintani-Guardia, Ott, 2002), а у крысы - бистра-тифицированные (Dann, Buhl, 1987). До сих пор считается, что эти клетки у животных разных видов представлены одним морфологическим типом. Исследование их пространственного распре-
деления по сетчатке методом "ближайшего соседа" показало, что они расположены неслучайным образом, но слабо упорядочены (Dunn, Buhl, 1987; Подугольникова и др., 1992; Zhang, Eldred, 1994).
При исследовании развития сетчатки было установлено, что дендритные поля нейронов формируются в условиях конкуренции с дендри-тами соседних клеток того же функционального типа, что минимизирует их территориальное перекрытие (Cook, 2О03). Именно при расположении клеток каждого функционального типа в виде регулярной решетки (мозаики) обеспечивается восприятие разных видов зрительной информации по всему полю зрения. Как правило, пространственные свойства сетей с разными функциями независимы, и их мозаики также независимы. В виртуозных экспериментах на кроликах, выполненных с помощью трейсинг-методов с последующим внутриклеточным отведением реакций от дирекционально-чувствительных ганглиозных клеток и их внутриклеточным окрашиванием, были получены физиологические и анатомические доказательства того, что клетки с разной предпочтительностью к направлению движения стимула формируют независимые регулярные мозаики (Vaney, 1994; Amthor, Oyster, 1995). При этом их большие дендритные ветвления практически не образуют перекрытий с соседними клетками того же типа. Используя метод пространственных коррелограмм (Rodieck, 1991), нам удалось установить, что у разных позвоночных (лягушка, черепаха, цыпленок, крыса) ганглиозные клетки, проецирующиеся в ДЗС, расположены в сетчатке в виде нескольких налагающихся друг на друга независимых регулярных пространственных решеток (Cook, Podugolnikova, 2001).
Так как у лягушки и ганглиозные клетки сетчатки, и центральные нейроны ДЗС обнаруживают предпочтительность к трем направлениям движения стимула (Cochran et al., 1984; Бастаков и др., 1992) и расположены в виде налагающихся, пространственно независимых регулярных решеток (Cook, Podugolnikova, 2001), можно предположить, что эти решетки образованы клетками с предпочтением к разным направлениям движения стимула. Тогда легко объяснить низкий уровень упорядоченности распределения по сетчатке тел ганглиозных клеток ДЗС, показанный методом "ближайшего соседа" (Подугольникова и др., 1992).
Задача нашего исследования - изучение морфологии и проведение морфометрического анализа ганглиозных клеток лягушки, проецирующихся в БОЯ, с целью разработки более детальной их классификации.
Некоторые результаты этого исследования были опубликованы в виде кратких сообщений (Кондрашев и др., 2005; Пущин и др., 2006).
МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования, постановка меток и приготовление препаратов. Исследование проводили на взрослых лягушках Rana temporaria. Животных анестезировали насыщенным раствором уретана (25%), инъецируя 0.15-0.2 мл раствора внутрибрюшинно, укрепляли на специальной подставке и вскрывали череп в области зрительной хиазмы со стороны нёба. Затем острой тонкой иглой делали прокол с одной стороны мозга в области БОЯ и помещали в место прокола кристаллики пероксидазы хрена (SIGMA, Type VI). Через 20-30 мин черепную кость и кожу помещали на место, нёбо зашивали и в течение 10-12 дней лягушку содержали во влажном аквариуме при комнатной температуре. После периода переживания животных адаптировали к темноте в течение 1-1.5 ч, давали им глубокую анестезию, перфузировали 0.6%-ным физиологическим раствором через брюшную вену и декапитировали. Быстро проводили энуклеацию, глаза вскрывали, помещали в 0.1 М фосфатный буфер (pH 7.3) и аккуратно удаляли передние среды глаза (роговицу, хрусталик и стекловидное тело). Затем в свежей порции буфера сетчатку отделяли от склеры, очищали от пигментного эпителия, делали несколько радиальных надрезов и приклеивали к желатинизированному предметному стеклу фоторецепторами вниз. Препарат фиксировали в течение 30 мин в смеси 2.5%-ного глютарового альдегида на фосфатном буфере, потом тщательно промывали в нескольких сменах фосфатного буфера и проявляли пероксидазу хрена согласно методу Адамса (Adams, 1977), используя 0.05%-ный раствор 3,3'-диаминобензидина и 0.05%-ный раствор хлорида кобальта на 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.3). Затем препараты промывали в течение 1 ч в шести сменах фосфатного буфера, обезвоживали по ряду спиртов возрастающей концентрации, просветляли в двух сменах ксилола и заключали в среду DPX.
Для определения правильности места аппликации и транспортировки пероксидазы хрена, мозг выделяли из черепа, фиксировали в течение 1 сут и также обрабатывали по методу Адамса. При обезвоживании мозг проводили по батарее спиртов возрастающей концентрации до 70%-ного этанола, в котором его хранили необходимое время.
Морфологический анализ клеток. Для определения взаиморасположения клеток в сетчатке был применен метод, разработанный Куком (Cook, 1987). Согласно этому методу, к предметному стеклу под сетчаткой прикрепляли фотографическую пленку с квадратной решеткой, сторона квадрата которой равнялась 500 мкм. Эту решетку использовали как систему координат. Границы сетчатки с рисунков при помощи дигитайзера вводили в компьютер и отмечали курсо-
Рис. 1. Карта сетчатки с указанием расположения выкрашенных ганглиозных клеток. В, N V, Т - соответственно дорзальная, назальная, вентральная и темпоральная зоны сетчатки.
Пунктирной линией обозначена область расположения клеток, выбранных для морфометрического анализа. Шкала = 1 мм.
ром расположение клеточных тел. Морфологию ганглиозных клеток исследовали со световым микроскопом Leitz Biomed при увеличении х600 и х1250. Для каждой клетки определяли размер и уровень расположения клеточного тела в сетчатке, количество основных дендритов, отходящих от тела клетки, отмечали способ отхождения аксона. Уровень ветвления дендритов ганглиозных клеток во внутреннем синаптическом слое (ВСС) определяли относительно слоя тел ганглиозных клеток и границы внутреннего ядерного слоя (ВЯС) в той же точке сетчатки. Фотографии делали с использованием микроскопа Axioplan 2 (Zeiss) при помощи аналоговой видеокамеры высокого разрешения SONY и компьютерного программного обеспечения KS300 (Zeiss).
Морфометринеский анализ клеток. Для проведения сравнительного морфометрического анализа клетки с наиболее
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.