БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 5, с. 716 - 722
УДК 577.24
МОРФОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ МИТОХОНДРИЙ КАРДИОМИОЦИТОВ ПРИ СТАРЕНИИ
© 2015 Ч.М. Эльдаров13, В.Б. Вайс13, И.М. Вангели13, Н.Г. Колосова2, Л.Е. Бакеева1,3*
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва;
факс: +7(495)939-3181, электронная почта: fhb@belozersky.msu.ru, bakeeva@belozersky.msu.ru
2 Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090 Новосибирск,
пр. Академика Лаврентьева, 10; факс: +7(383)333-1278
3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИМитоинженерии, 119991 Москва; факс: +7(495)939-5945,
электронная почта: info@mitotech.ru
Поступила в редакцию 17.12.14 После доработки 28.01.15
Разработанный нами новый метод морфометрического анализа митохондрий использован для изучения состояния ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов крыс ""Маг и ОХУ8 в возрасте 3 и 24 мес. Полученные результаты полностью подтверждают данные электронно-микроскопических наблюдений: выявлено значительное снижение с возрастом площади внутренней мембраны митохондрии на единицу объема митохондрии на срезе сердечной мышцы крыс. Контрольное значение этого показателя для крыс ""^аг в возрасте 3 мес. составило 41,3 ± 1,52 мкм2/мкм3. Для крыс ОХУЪ в возрасте 3 мес. данный показатель оказался сниженным и составил 30,57 ± 1,74 мкм2/мкм3. С возрастом площадь внутренней мембраны на единицу объема митохондрий у обеих групп животных снижалась — с 41,3 ± 1,52 до 21,47 ± 1,22 мкм2/мкм3 у ""^аг и с 30,57 ± 1,74 до 16,3 ± 0,89 мкм2/мкм3 у ОХУЪ. Разработанный и использованный нами метод мор-фометрического анализа значительно упрощает процесс морфометрических измерений, открывая хорошие возможности для его дальнейшей оптимизации с использованием технологий распознавания изображений.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: морфометрия, старение, ультраструктура, кардиомиоциты.
В настоящее время все большее внимание уделяется исследованиям процессов, связанных со старением, в т.ч. возраст-зависимых изменений органов и тканей. Одно из ведущих направлений — изучение возрастных изменений миокарда, поскольку болезни сердца входят в число главных причин смертности населения. По данным Всемирной организации здравоохранения доля сердечно-сосудистых заболеваний в числе патологий, развивающихся с возрастом, неуклонно растет с каждым годом [1].
На основании свободнорадикальной теории Хармана [2] была сформулирована митохондри-альная теория старения, расширенная затем В.П. Скулачевым. Согласно этой теории главным фактором развития возрастных изменений органов и тканей является изменение функционального состояния митохондрий вследствие образования этими органеллами избыточного количества активных форм кислорода (АФК)
* Адресат для корреспонденции.
[3—7]. Вызываемый АФК окислительный стресс играет центральную роль в процессе нормального физиологического старения, а также этиологии множества серьезных патологий миокарда [8—15]. Хорошо известна связь функционального состояния митохондрий с изменениями их ультраструктуры [16—20]. Поэтому исследования морфологических изменений митохондрий, обусловленных возрастом, чрезвычайно перспективны, поскольку нарушения ультраструктуры митохондрий возникают значительно раньше, нежели появление выявляемых клинически симптомов заболеваний. В то же время характерная ультраструктура митохондрий указывает на изменения функционального состояния ткани и, как следствие, на начало развития патологических процессов.
При проведении исследований по ультраструктуре митохондрий важную роль играет не только качественная, но и количественная оценка получаемых данных с помощью методов морфометрического и стереологического ана-
лиза ультраструктуры митохондрий. Общепринятым подходом является измерение длины и ширины этих органелл, общей и средней площади сечения отдельных митохондрий, объемной доли митохондрий в объеме среза, а также площади внутренней мембраны на единицу объема митохондрий [21, 22]. Основным является метод наложения на изображение различных систем точек, отрезков, концентрических дуг и окружностей с последующим подсчетом числа точек, попавших на структуры, или количества пересечений тестовых линий [23—25]. Данные методы отличаются высокой трудоемкостью и необходимостью проведения большого количества измерений, что требует значительных затрат времени для этих подсчетов. Использование компьютерных программ для анализа данных электронной микроскопии — распознавания и обработки изображений — позволяет упростить и сократить количество измерений, необходимых для оценки морфометрических параметров митохондрий и, в частности, расчета площади внутренней мембраны митохондрии на единицу объема митохондрии — одного из наиболее важных морфометрических параметров, позволяющего оценить функциональное состояние митохондрий. Применение компьютерных графи -ческих пакетов открывает возможности для дальнейшей автоматизации процесса анализа электронно-микроскопических фотографий.
Целью данной работы являлось применение предложенного нами метода морфометрическо-го анализа митохондрий в автоматическом и полуавтоматическом режимах для анализа результатов электронно-микроскопического исследования. Предложенный метод мы использовали для морфометрической обработки выявленных нами ультраструктурных изменений митохондрий кардиомиоцитов крыс ^^аг и ОХУ8 при старении. Линия крыс ОХУ8 является уникальной моделью для исследования роли окислительного стресса в развитии возраст-зависимых патологий. Животных этой линии отличают ранние инволютивные изменения внутренних органов и нарушения функций высшей нервной деятельности, характерные для стареющих животных и человека. Ключевой характеристикой крыс ОХУ8 является усиленная генерация радикалов кислорода, выявляемая в тканях животных [26].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Животные. Модель преждевременно стареющих крыс ОХУ8 была выведена в Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН
из линии Wistar путем отбора крыс, наиболее восприимчивых к катарактогенному эффекту галактозной диеты, и их близкородственного скрещивания [27, 28]. Линия зарегистрирована в международной базе данных Rat Genome (http://rgd.mcw.edu). К настоящему моменту имеется 99-е поколение OXYS с синдромом ускоренного старения.
Работа выполнена на крысах-самцах Wistar (n = 15) и OXYS (n = 15) в возрасте 24 мес., полученных из Центра коллективного пользования «Генофонды экспериментальных животных» ИЦиГ СО РАН. Животных содержали группами по пять особей при естественном освещении, температуре 22 ± 2° и свободном доступе к воде и корму (PK-120-1, «Лабораторснаб», Россия). В качестве контроля для оценки возрастных изменений ткани миокарда было использовано по пять крыс Wistar и OXYS в возрасте 3 мес.
Все процедуры, выполненные на животных, проводились в соответствии с Директивой Совета Европейского союза № 86/609/EES.
Электронная микроскопия. Для электронно-микроскопического исследования забирали ткань стенки левого желудочка. Материал фиксировали 3%-ным раствором глутарового альдегида в фосфатном буфере (рН 7,4) в течение 2 ч при 4°, затем дофиксировали 1%-ным раствором четырехокиси осмия в буфере в течение 1,5 ч и обезвоживали в растворах спиртов с возрастающей концентрацией спирта (70%-ный спирт был насыщен уранилацетатом). Материал заливали в эпоксидную смолу Эпон-812. Серийные ультратонкие срезы делали на ультрамикротоме «Leica» (Германия), окрашивали свинцом по Рейнольдсу. Полученные препараты просматривали и фотографировали в электронном микроскопе H-12 («Hitachi», Япония). Фотографии на пленке затем были отсканированы с разрешением 1200 и 2400 dpi.
Морфометрия и статистический анализ. Для морфометрического исследования было отобрано по 50 электронно-микроскопических фотографий миокарда на каждую группу животных. Каждый снимок сканировался с определенным разрешением (dpi), что позволило вычислить масштаб каждого снимка — количество пикселей фотографии на единицу реальной длины (1 нм) — по формуле:
Kpix/nm = M х Rs/25,4 х 106, (1)
где M — увеличение микроскопа, Rs — разрешение сканирования.
На каждом снимке вручную выделялись отдельные митохондрии, затем внутри каждой митохондрии выделялась внутренняя мембрана
(рис. 1, а—в; см. цветную вклейку). Ширина линии при выделении мембран выбиралась согласно значению k (пикс/нм), вычисленному по формуле (1), принимая среднюю ширину внутренней мембраны митохондрии на снимке равной 75 А (рис. 1, а—в). Учитывая масштаб снимка, а также известную толщину среза порядка 700 А, с помощью пакета анализа данных в Adobe Photoshop («Adobe Systems, Inc.», США) были вычислены различные морфометрические параметры, такие как площадь внутренней мембраны митохондрии в объеме среза, общая длина внутренней мембраны митохондрии и объем митохондрии в срезе. При этом использовалось допущение о том, что измеряемые мембраны строго перпендикулярны плоскости среза. Неперпендикулярные мембраны будут просто не видны на снимке, погрешность при использовании этого допущения не превышает 4%. С помощью полученных данных была рассчитана площадь поверхности внутренней мембраны (мкм2) на единицу объема митохондрии (мкм3). Для статистической обработки морфометричес-ких данных использовался пакет STATISTICA 8 («StatSoft Inc.», США). Степень достоверности определялась с помощью критерия Манна— Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На рис. 2, а представлена характерная картина ультраструктуры митохондрий кардиомиоци-тов крыс М^аг в возрасте 3 мес. Ультраструктура митохондрий соответствует функционально-активному ортодоксальному состоянию по классификации Грина [29]. Внутренняя мито-хондриальная мембрана образует множественные кристы, отходящие внутрь органеллы плотными параллельными рядами, заполняющими все внутреннее пространство митохондрий. Матрикс хорошо выраженный, межмембранное пространство (узкие просветы внутри крист и между наружной и внутренней митохондриальной мембранами) электронно-светлое. На рис. 2, б представлена картина ультраструктуры митохондрий, характер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.