научная статья по теме МОРСКИЕ БЕСПОЗВОНОЧНЫЕ ОХОТСКОГО МОРЯ КАК НОВЫЕ ИСТОЧНИКИ ЛИПОПОЛИСАХАРИД-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ Биология

Текст научной статьи на тему «МОРСКИЕ БЕСПОЗВОНОЧНЫЕ ОХОТСКОГО МОРЯ КАК НОВЫЕ ИСТОЧНИКИ ЛИПОПОЛИСАХАРИД-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ»

БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2014, том 40, № 1, с. 63-69

УДК592.+571.27 БИОХИМИЯ

МОРСКИЕ БЕСПОЗВОНОЧНЫЕ ОХОТСКОГО МОРЯ КАК НОВЫЕ ИСТОЧНИКИ ЛИПОПОЛИСАХАРИД-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ1

© 2014 г. С. И. Бахолдина1, Г. А. Набережных1, В. И. Горбач1, М. П. Исаева1'2, Т. Ф. Соловьева1

'Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова (ГИБОХ)ДВО РАН, Владивосток 690022; 2Далъневосточный федеральныйуниверситет, Школа биомедицины, Владивосток 690950

e-mail: sibakh@mail.ru

Статья принята к печати 28.03.2013 г.

Впервые морские беспозвоночные Охотского моря изучены в качестве источника белков, способных связываться с липополисахаридами (ЛПС) грамотрицательных бактерий. Разработанный нами ДОТ-анализ с использованием ЛПС, содержащих дансильную флуоресцентную метку, позволил обнаружить ЛПС-связывающие белки в лизатах клеток крови у 21 из 33 исследованных видов беспозвоночных. Среди исследованных животных большинство видов с положительной ЛПС-связывающей активностью принадлежит к десятиногим ракообразным (класс Malacostraca, тип Arthropoda). Показано, что в лизатах гемоцитов камчатского краба Paralithodes camtschaticus и северного шримса Sclerocrangon boreas присутствуют несколько ЛПС-связывающих белков с разной молекулярной массой. Впервые ЛПС-связывающие белки найдены у иглокожих (классы Holothuroidea, Asteroidea, Echinoidea), сипункулид и брахиопод.

Ключевые слова: морские беспозвоночные, врожденный иммунитет, ЛПС-связывающие белки, Охотское

море.

Marine invertebrates of the Sea of Okhotsk as a new source of lypopolysaccharide-binding proteins.

S. I. Bakholdina1, G. A. Naberezhnykh1, V. I. Gorbach1, M. P. Isaeva1-2, T. F. Solov'eva1 ('Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690022; 2Far Eastern Federal University, School ofBiomedicine, Vladivostok 690950)

Invertebrates from the Sea of Okhotsk were studied as a source of proteins that are capable of binding to lipopoly-saccharides (LPS) of gram-negative bacteria. DOT-analysis using dansyl-labeled LPS developed by us revealed LPS-binding proteins in blood cell lysates of 21 out of 33 investigated species of invertebrates. Most of the investigated species with positive LPS-binding activity were decapod crustaceans (class Malacostraca, phylum Arthropoda). Hemocyte lysates from the crab Paralithodes camtschaticus and the shrimp Sclerocrangon boreas contained several LPS-binding proteins with different molecular mass. LPS-binding proteins were found in echinoderms (classes Holothuroidea, Asteroidea, and Echinoidea), sipunculans, and brachiopods forthe first time. (Biologiya Morya, 2014, vol. 40, no. 1, pp. 63-69).

Keywords: marine invertebrates, innate immunity, LPS-binding proteins, Sea ofOkhotsk.

Беспозвоночные животные, в отличие от позвоночных, не имеют адаптивного иммунитета, поэтому для защиты от внедрения чужеродных агентов используют только систему врожденного иммунитета. Антимикробная функция врожденного иммунитета реализуется с помощью специфических "узнающих" белков (pattern recognition proteins, PRPS), которые связываются с определенными молекулами на поверхности патогена (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs), что приводит к активации всей системы иммунитета (Vazquez et al., 2009). В грамотрицательных бактериях одним из таких соединений является липополисахарид (ЛПС). Молекула ЛПС имеет амфифильную природу и состоит из трех частей: липида А, олигосахарида кора и О-полисахаридной цепи. Белки "узнавания" ЛПС, получившие название ЛПС-связывающие белки, могут взаимодействовать как с липидной, так и с углеводной

частями молекулы ЛПС (Koshiba et al., 2007; Kawabata, Muta, 2010). При связывании этих белков с ЛПС включаются такие защитные механизмы беспозвоночных, как коагуляция гемолимфы (Vazquez et al., 2009) и активация фенолоксидазной системы (Lee et al., 2000). Поэтому препараты, способные стимулировать синтез ЛПС-связывающих белков, рассматриваются сегодня как потенциальные новые антимикробные средства.

В настоящее время ЛПС-связывающие белки изучены у сравнительно небольшого числа видов беспозвоночных. В основном это мономерные белки с молекулярной массой от 40 до 175 кДа. Установлено, что ЛПС-связывающие белки синтезируются в различных тканях беспозвоночных, но максимальное содержание этих белков обнаружено в клетках крови (Zhao et al., 2009). В опытах по заражению ракообразных патогенными бактериями показано, что ЛПС-связывающие белки

1 Работа выполнена при частичной финансовой поддержке грантов Президиума ДВО РАН"Молекулярная и клеточная биология" № 09-1-и22-06 и

Министерства образования и науки РФ (Гос. задание 4.2007.2011).

являются индуцибельными; экспрессия их значительно возрастает уже через несколько часов после инфицирования животных грамотрицательными бактериями или введения ЛПС (Liu et al., 2009).

Изучение белков, играющих важную роль в защите от бактериальной инфекции, позволит лучше понять функционирование системы врожденного иммунитета беспозвоночных, что поможет разработать антимикробные препараты нового поколения. Потребность в таких препаратах для беспозвоночных в настоящее время возрастает в связи с развитием марикультуры. Кроме того, ЛПС-связывающие белки могут представлять интерес как потенциальные средства для терапии эндотоксе-мии и грамотрицательного сепсиса у человека (Otero-Gonzalez et al., 2010).

Следует отметить, что изученные в настоящее время ЛПС-связывающие белки найдены у видов, которые обитают в тропических морях Юго-Восточной Азии и, как правило, являются объектами марикультуры стран этого региона. У беспозвоночных северных морей поиск таких белков ранее не проводился.

Цель данной работы - выявить среди принадлежащих к разным систематическим группам морских животных Охотского моря виды, перспективные для выделения ЛПС-связывающих белков.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Морских беспозвоночных добывали методом драгирования в Охотском море (район средних Курил) с глубины 50-600 м во время 41-го экспедиционного рейса на НИС "Академик Опарин" (июль 2011 г.). Кровь (гемолимфу или целомическую жидкость) из свежевыловленных животных собирали стерильным шприцем и смешивали 1 : 1 (по объему) с антикоагулирующим буфером, содержащим 0.14 MNaCl, 0.1 М глюкозы, 30 мМ цитрата натрия, 26 мМ лимонной кислоты, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ), рН 4.6. Клетки крови осаждали центрифугированием при 8001000 об/мин в течение 10 мин.

Получение ЛПС, меченного дансилом и биотинам

Для синтеза липополисахарида, меченного флуоресцентным красителем дансилом (Д-ЛПС), 20 мг ЛПС Escherichia coli штамм 0 : 55 : В5 (Fluca, Германия) растворяли в 3 мл 0.01 М NaHC03 (рН 9.5), добавляли раствор 3.5 мг дансилхлори-да (Sigma, США) в 2.5 мл диметилсульфоксида, полученную смесь выдерживали в течение ночи при 37°С. Реакционную смесь диализовали в течение 48 ч против воды и лиофилизо-вали.

Для введения биотина к 6 мг ЛПС в 1 мл 0.1 М NaHC03 (рН 8.3) добавляли 1 мг N-гидроксисукцинимидного эфира биотинамидогексановой кислоты (Sigma, США), растворенного в 0.1 мл диметилсульфоксида, и инкубировали смесь в течение 16 ч при 37°С. Полученный ЛПС, меченный биотином (Б-ЛПС), диализовали в течение 48 ч против воды и лиофили-зовали.

Обнаружение ЛПС-связывающих белков ДОТ-анализам

Присутствие ЛПС-связывающих белков в лизатах клеток крови морских беспозвоночных определяли с помощью экс-

пресс ДОТ-анализа, используя Д-ЛПС. Образцы клеток крови (20 мг сырой массы) лизировали в 20 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ KCl, 1 мМ ФМСФ, pH 7.5; лизат наносили по 5 мкл на нитроцеллюлозную мембрану (0.2 мкм, Sartorius, Германия), высушивали на воздухе и фиксировали 0.25% раствором глутарового альдегида в воде в течение 30 мин. Для забивки неспецифических мест связывания мембрану обрабатывали 0.01 М фосфатно-солевым буфером (PBS: 0.01 М NaH2P04 + 0.15 М NaCl; pH 7.5), содержащим 0.25% Tween-20 (PBS-T). Инкубирование нитроцеллюлозы с Д-ЛПС (20 мкг/мл в PBS-T) проводили в течение 2 ч при 37°С. Для визуализации пятен использовали флуоресцентную лампу NU-6 KL (Германия). В качестве положительного контроля использовали полимиксин В (ПМ-В). Данный экспресс метод позволяет обнаружить до0.15 мкг ПМ-В в пятне.

Количественное определение ЛПС-связывающей активности ДОТ- и лиганд-ферментным твердофазным анализом

Для количественного ДОТ-анализа ЛПС-связывающих белков лизаты, полученные из равного по массе количества клеток крови (гемоцитов) краба и креветки, двукратно титровали на отдельном планшете. Концентрация общего белка в лизатах клеток крови краба и креветки, определенная по методу Брэдфорд (Bradford, 1976), составила 2.74 и 8.08 мг/мл соответственно. Лизаты наносили на нитроцеллюлозу по 5 мкл. Мембраны обрабатывали, как описано выше. Флуоресценцию комплексов Д-ЛПС-белок регистрировали с помощью системы изображения Versa Doc (Bio-Rad, США) при длине волны возбуждения 340 нм, эмиссии 520 нм и оцифровывали, используя программу Quantity One 1-D. Количественное содержание ЛПС-связывающих белков рассчитывали, используя калибровочную кривую по полимиксину В (от 0.15 до 5 мкг в пятне) и по среднему значению молекулярной массы ЛПС-связывающих белков в лизате, определенной с помощью денатурирующего электрофореза в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) (для креветки - 90 кДа, для краба - 85 кДа).

Для проведения лиганд-ферментного твердофазного анализа (ЛТФА) в лунки полистирольного планшета Polysorp (Nunc, США) вносили по 0.1 мл лизата клеток краба или креветки и инкубировали в течение 16 ч при 37°С. Неспецифические места связывания блокировали PBS-T. Планшеты отмывали PBS-T, в лунки вносили 0.1 мл раствора Б-ЛПС в разных концентрациях (0.08-2 мг/мл) и выдерживали в течение 4 ч при 37°С. После инкубации планшеты промывали PBS-T, в лунки добавляли конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена в разведении 1 : 1000 и выдерживали в течение 1 ч при 37°С. Количество связавшегося Б-ЛПС определяли, измеряя оптическую плотность раствора после добавления субстрата к ферменту. В качестве хромогена в суб

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком