МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 4, с. 508-511
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.28.017.6:577.125
МОРСКОЙ ГРИБ STILBELLA ACICULOSA КАК ВОЗМОЖНЫЙ ПРОДУЦЕНТ ПРОСТАГЛАНДИНОВ
© 2008 г. Т. В. Кафанова, Н. Г. Бусарова, Ю. В. Худякова, С. В. Исай1
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток Поступила в редакцию 18.06.2007 г.
Методами ГЖХ, ГХ-МС охарактеризован состав и содержание жирных кислот гриба Stilbella acicu-losa, ассоциированного с морским макроорганизмом Apostichopus japonica (трепанг). Методом УФ-спектроскопии показано, что культуральная среда штамма гриба S. aciculosa содержит проста-гландины (ПГ) групп E и F, косвенным подтверждением чему служит обнаружение в ней эйкозапен-таеновой и докозагексаеновой полиненасыщенных жирных кислот, являющихся прямыми предшественниками ПГ, а биомасса штамма гриба содержит ПГ группы B.
Ключевые слова: морской гриб Stilbella aciculosa, жирные кислоты, простагландины.
Среди микроорганизмов (МО) наименее изученными являются грибы из морских сред обитания (МГ). Литература по грибам ограниченна и представлена преимущественно наземными эко-формами этих микроорганизмов. Показано, что штамм гриба Mortierella alpina является продуцентом арахидоновой кислоты (20 : 4) [1]. Мицелий дрожжеподобного гриба Candida rugosa содержит до 40% 20 : 4, прямого предшественника проста-гландинов (ПГ) [2]. В грибах найдены длинноцепо-чечные гидрокси-жирные кислоты [3]. Aspergillus fischerii содержит ПГ синтон терреин, который имеет правильную абсолютную конфигурацию, требуемую для синтеза ПГ [4]. Штамм почвенного гриба Fusarium sambucinum продуцирует ПГ E2 и F2a [5]. Из гриба Aspergillus nidulans, являющегося моделью для исследования процессов развития гриба, выделены гены оксилипина, ответственного за процессы полового и бесполого размножения [6]. Наряду с Aspergillus sp. и Mortierella sp., исследовались и другие виды грибов, способные продуцировать ПГ [7]. В биологии возникло новое направление - микробная эндокринология, и оно непосредственно связано с грибами: процесс репродукции грибов стимулируется олеиновой (18 : 1), линоленовой (18 : 3) и 20 : 4 жирными кислотами (ЖК) [8].
Цель работы - поиск штамма-продуцента ПГ и характеристика его липидного состава среди грибов, ассоциированных с морскими макроорганизмами, обладающими высокой ПГ активностью. Такими макроорганизмами, по нашим данным [9], являются Apostichopus japonica (трепанг) и Cucu-maria japonica (кукумария).
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: isai@piboc.dvo.ru).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали штаммы МГ, выделенных с поверхности трепанга и кукумарии. Культивирование грибных штаммов проводили на питательной среде следующего состава: жидкое пивное сусло - 20 мл, морская вода - 80 мл, pH 7.8 [10, 11]. Содержание глюкозы в сусле 0.044 г/л [11]. Культивирование производили в колбах Эрленмейера объемом 0.25 л со 100 мл среды приведенного состава, в которой изначально отсутствовали ЖК. Время культивирования 7 сут, температура культивирования 22°С.
Из Apostichopus japonica выделены штаммы следующих видов грибов: Cladosporium atroseptum Pidopl., Cladosporium brevicompactum Pidopl. et De-niak, Trichoderma viride Pers., Aspergillus fumigatus Fresen., Alternaria alternate (Fr.) Keissl., Stilbella aciculosa (Ellis et Everh.) Seifert; из Cucumaria japonica: Cladosporium brevicompactum Pidopl. et Deniak.
Работали как с биомассой, так и культураль-ной жидкостью указанных выше штаммов.
Приготовление экстрактов из биомассы грибов выполняли по ранее описанной методике [12]. Биомассу штаммов грибов (20 г), отделенную от культуральной среды центрифугированием, заливали 100 мл этанола, подкисленного 0.5 мл 40% уксусной кислотой. Из зафиксированных таким образом образцов были приготовлены экстракты, условно называемые нами простагландиновыми. Зафиксированную подкисленным этанолом биомассу отделяли от экстракта центрифугированием. Далее биомассу экстрагировали эфиром. Верхнюю фазу отделяли, упаривали и добавляли смесь гексан-70% водный этиловый спирт (1 : 1 по объему), встряхивали. Нижнюю фазу отделяли, упари-
вали, подкисляли, экстрагировали эфиром. Эфирную фазу упаривали, растворяли в смеси хлороформ-метанол (1 : 1), пропускали аргон, хранили при -4°С. Культуральную жидкость, отделенную от биомассы и упаренную до минимального объема, обрабатывали описанным выше способом.
УФ-спектроскопия. Съемка УФ-спектров спиртовых и метанольных вытяжек биомассы и культу-ральной жидкости в области 200-280 нм выполнена до и после их щелочной обработки на спектрофотометре Cecil CE 7200 ("Aquarius", Великобритания). Использовали кварцевые кюветы длиной 1 см емкостью 1 мл.
Тонкослойная хроматография (ТСХ) экстрактов выполнена на пластинках заводского изготовления Sorbfil ПГСХ-АФ-А в системах: бензол-этил-ацетат-муравьиная кислота (75 : 15 : 1); хлороформ-этилацетат-этанол-уксусная кислота (20 : 20 : 4 : 1); петролейный эфир-серный эфир-уксусная кислота (82 : 18 : 1). Последняя система для отделения смеси ПГ и фосфолипидов от нейтральных липидов. Реагенты для обнаружения ПГ: 1% ванилин в 15% фосфорной кислоте в этаноле; 10% серная кислота в этаноле.
ГЖХ анализ жирных кислот. Метиловые эфи-ры жирных кислот получали по методу Хартмана с соавт. [13] и анализировали на хроматографе Agilent 6850 (Германия). Капиллярная колонка (30 м х 250 мкм х 0.25 мкм), фаза - HP-5-MS-5% (phenylmethylsiloxane), газ-носитель - гелий, температура 220°, режим изотермический.
ГХ-МС анализ жирных кислот выполняли на приборе Hewlett Packard, model 6890.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Приготовленные экстракты из биомассы штаммов грибов и культуральной жидкости подвергали скринингу методом УФ-спектроскопии. Наличие циклопентанового кольца, характерной структурной компоненты любого ПГ, определяют УФ-спектроскопией [14]. Известно, что три группы ПГ поглощают в УФ области. ПГ Е2 при 205 нм (е 4400), ПГ Ах при 217 нм (е 13400), ПГ Вх при 278 нм (е 10950). Известно также, что в щелочных или кислых условиях ПГ групп А и Е переходят в ПГ группы В [15].
Некоторые виды МО синтезируют и выделяют в среду липиды в значительных количествах, причем состав внеклеточных липидов отличается от состава внутриклеточных [16]. Поэтому в своей работе мы исследовали как биомассу штаммов грибов, так и культуральную жидкость. Наиболее четкие спектры получены для штамма S. aciculosa, поэтому последующие исследования связаны с этим штаммом. В экстракте из культуральной жидкости в спектре до щелочной обработки были отмечены пики при 207, 252 и 274 нм. После щелочной обработки по-
явился четкий пик при 280 нм, что соответствует ПГ группы В, и пик при 213 нм. УФ спектр экстракта биомассы 5. аатЫа до щелочной обработки имел пики при 213 нм и размытый пик при 278 нм. После щелочной обработки остался пик при 213 нм, а пик при 278 нм стал четким, т.е. можно предположить, что в биомассе 5. ааеыЫа изначально присутствовал ПГ группы В, сохранившийся при щелочной обработке.
Для дополнительного доказательства присутствия ПГ в биомассе и культуральной жидкости штамма 5. ас1сы1о8а была выполнена ТСХ с обнаружением ПГ специфическими реагентами. Экстракт из культуральной жидкости при обнаружении пятен 1% ванилином в этаноле давал четкое пятно с величиной Яь соответствующей ПГ Е2. Далее провели препаративную ТСХ, чтобы очистить экстракт от нейтральных липидов. Собрали оставшуюся на старте фракцию, состоящую из ПГ и фосфолипидов (ФЛ). Для этой суммарной фракции выполнили качественную ТСХ, используя в качестве специфического реагента 1% ванилин в 15% фосфорной кислоте в этаноле. На хро-матограмме было отмечено пятно желто-зеленого цвета с величиной Яь соответствующей ПГ Е2. Затем эту же пластинку обработали 10% серной кислотой в этаноле, на ней проявилось еще два пятна, одно из них по значению ^ можно отнести к ПГ F2a. Кроме того, суммарную фракцию ПГ и ФЛ проанализировали в дополнительной системе хлороформ-этилацетат-этанол-уксусная кислота (20 : 20 : 4 : 1); обнаружение на пластинках проводили 1% ванилином в 15% фосфорной кислоте в этаноле. Проявилось три пятна, которые по ^ и окрашиванию можно отнести к F2a и Е2, и третье, окрашенное в желтый цвет, можно отнести либо к эфирам ПГ Е2, либо к ПГ В2. Для препаративно выделенной фракции (ПГ + ФЛ) из экстракта культуральной жидкости также была выполнена УФ-спектроскопия. Она подтвердила образование четкого пика при 280 нм после щелочной обработки аликвоты фракции.
Таким образом, по предварительным результатам можно предположить, что в культуральной жидкости гриба 5. aciculosa из А. ]аротса находятся ПГ Е2 и F2a. ТСХ, выполненная для экстракта из биомассы гриба 5. aciculosa, показала присутствие ПГВ.
Анализ ЖК экстрактов биомассы и культуральной жидкости представлен в таблице. После приготовления метиловых эфиров ЖК перед ГЖХ анализом их очищали от сопутсвующих веществ препаративной ТСХ на силикагеле КСК в бензоле. Составы ЖК биомассы и культуральной жидкости заметно отличались. Общим являлось превалирование ненасыщенных ЖК. В биомассе основным является семейство С18 кислот и отсутствие полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). В куль-
510
КАФАНОВА и др.
Состав и содержание жирных кислот в штамме гриба aciculosa (% от суммы метиловых эфиров жирных кислот)
Жирная кислота Биомасса гриба Культуральная жидкость
14 0 0.55 4.00
15 0 0.70
16 0 25.60 15.20
16 0i 1.2
Тетраметил-16 0 2.25
16 1n7 1.45
16 1n9 10.50
17 0 0.75
17 1 n9 0.70
18 0 3.66 2.50
18 1 n8 7.70
18 1 n9 32.30 18.00
18 2n6 29.70
18 4n3 1.60
19 1 n9 1.80
19 2n6 1.35
20 1 n9 6.20
20 1 n15 6.80
20 5n3 7.90
22 1 n9 2.10
22 1n11 8.90
22 6 6.30
2 насыщенных ЖК 32.50 24.00
2 ненасыщенных ЖК 67.30 75.94
2 моноеновых ЖК 36.25 60.10
2 полиненасыщенных ЖК 15.90
туральной жидкости представлены эйкозапентае-новая (20 : 5), докозагексаеновая (22 : 6) ПНЖК, прямые предшественники ПГ. Полученные нами результаты трудно сравнивать с данными литературы, так как по исследованному нами грибу S. aciculosa нет данных в литературе. Есть информация по гриб
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.