ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 7, с. 943-954
^=ГЕНЕТИКА ^^^^^^^^^^^^^^^^
РАСТЕНИЙ
УДК 575:117.2 +577.21:633.71
МОЗАИЧНЫЙ ХАРАКТЕР ПРОЯВЛЕНИЯ ГЕНА прШ У ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТАБАКА NU 21
© 2007 г. Т. В. Маренкова (Новоселя), Е. В. Дейнеко, В. К. Шумный
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090;
факс: (383) 333-12-78; e-mail: deineko@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 01.09.2005 г.
Окончательный вариант получен 16.06.2006 г.
Описан мозаичный характер проявления маркерного гена nptII в клетках соматической ткани листовой пластинки у трансгенного растения табака Nu 21. Показано наследование данного фенотипа (в Тх-Т4 и у гибридов F1 от анализирующего скрещивания). Выделены три группы растений: с низкой частотой проявления мозаицизма (0—21.8%); с высокой частотой появления мозаичных потомков (63.1-100%) и промежуточный тип, где частота появления растений-мозаиков варьировала в широких пределах - от 0 до 100%. Полученные результаты свидетельствуют о существовании двух метастабильных состояний трансгена в клетках соматических тканей листовой пластинки (активного и неактивного), которое, возможно, связано с модификацией ДНК - метилированием цитозина в последовательности гена nptII.
Непредсказуемые изменения в экспрессии перенесенных генов - одна из проблем, с которыми сталкивается экспериментатор при создании и исследовании трансгенных растений. При условии стабильной экспрессии трансгенов их проявление среди потомков будет соответствовать доминантной мутации при полном доминировании и наследование будет подчиняться классическим законам Менделя [1, 2]. В случае нарушений экспрессии будут наблюдаться как отклонения от ожидаемых расщеплений [2-4], так и полная потеря экспрессии перенесенных генов [3-6]. Описаны случаи нестабильной экспрессии чужеродных генов, где их проявление выражается в виде мозаицизма, как чередование участков растительных тканей с активным и неактивным трансгеном. Такой паттерн экспрессии описан для генов прШ [7, 8], uidA [9, 10], хальконсинтетазы [11], люциферазы [12].
Известно, что инактивирование экспрессии трансгенов может происходить как на транскрипционном, так и на посттранскрипционном уровнях [13]. Получены мутации в растительных генах, влияющих на стабильность экспрессии перенесенных генов [13-15]. Показана роль метилирования ДНК [16] и изменения структуры хроматина [17, 18] в эпигенетической регуляции экспрессии гетерологичных генов. Описаны модельные линии трансгенных растений табака [8, 19, 20], риса [21], Arabidopsis {¡¡аНапа [11] с различным характером проявления экспрессии маркерных генов. Однако необходимо отметить, что данные по генетическому анализу трансгенных растений немногочисленны. В связи с этим цель настоящего исследования - гибридологический анализ моза-
ичного характера проявления маркерного гена nptII в трансгенных растениях табака линии Nu 21.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве модели для анализа нестабильной экспрессии гена nptII использовали трансгенное растение табака Nu 21, полученное нами ранее методом агробактериального переноса в растения Nicotiana tabacum L., линии SRI, генетической конструкции pC27-nuc/S (Е.А. Трифонова, лаб. генной инженерии растений ИЦиГ СО РАН) с маркерным геном nptII и целевым геном секреторной эндонуклеазы Serratia marcescens под управлением двунаправленного MAS-промотора гена маннопинсинтазы Ti-плазмиды Agrobacteri-um tumefaciens (рис. 1). Растение Nu 21 было выделено среди 34 независимо полученных трансгенных растений табака с данным типом генетической конструкции, однако в отличие от других трансформантов потомки этого растения харак-
RB nuclS pMAS nptII LB
Clal EcoRV Xbal, BamHI, ЯгЫШ, EcoRI PstI, PvuII
Рис. 1. Схема T-области генетической конструкции pC27-nuc/S. LB, RB - повторы, окаймляющие T-область Ti-плазмиды A. tumefaciens; nuc/S - ген секреторной нук-леазы Serratia marcescens; nptII - ген неомицинфосфо-трансферазы II E. co/i; pMAS - двунаправленный промотор гена маннопинсинтазы Ti-плазмиды A. tumefa-ciens.
теризовались мозаичным характером проявления маркерного гена nptII на уровне клеток соматических тканей листовых пластинок в условиях селективной среды (среда Мурашиге и Скуга [22] с добавлением 200 мг/л антибиотика канамицина). Проявление гена nptII исследовали среди потомков первого-четвертого поколений (Тх-Т4) от самоопыления исходного трансгенного растения Nu 21, а также среди гибридов F1 от анализирующего скрещивания Т1 и Т2 растений с диким типом (w.t., нетрансгенными растениями табака линии SRI) как в прямых, так и обратных комбинациях. Для анализа Т2 девять растений Т1 (Nu 21/1-Nu 21/9) с мозаичным проявлением экспрессии гена nptII были случайным образом отобраны на селективной среде. Для анализа Т3 и Т4, а также гибридов от анализирующего скрещивания были выбраны три номера Т1: Nu 21/5 - с минимальной частотой выщепления потомков-мозаиков по экспрессии маркерного гена, Nu 21/6 - с максимальной частотой и Nu 21/9 - с промежуточным типом. Для каждого из девяти трансгенных растений Т1 отбирали от 3 до 13 потомков Т2 и Т3 как с зеленой окраской, так и мозаиков в условиях селективной среды с антибиотиком канамицином. Скрещивание трансгенных растений проводили в 2-9 повторно-стях для одного и того же варианта с предварительным удалением пыльников и изоляцией цветков на материнском растении. Растения-регене-ранты были получены из эксплантов листьев растений Т1 c мозаичным проявлением nptII-гена в культуре in vitro, полученных от самоопыления исходного растения Nu 21. Для этого использовали только те растения, в потомстве которых проявление признака мозаицизма приближалось к 100%. Растения выращивали в гидропонной теплице при температурном режиме 24°/18°С (день/ночь) и фотопериоде 16/8 ч (день/ночь).
Стабильность экспрессии гена nptII оценивали по соотношению канамицин-устойчивых (Кш+) и канамицин-неустойчивых (Km) потомков (4-6 недель после развития зародыша). О стабильной экспрессии маркерного гена судили по его наследованию согласно законам Менделя. Нестабиль-
ный характер экспрессии анализируемого гена в поколениях регистрировали по отклонениям от менделевского расщепления, мозаичности проявлении Кш+-фенотипа в клетках соматических тканей (чередованию белых и зеленых секторов на листьях). Соответствие фактического расщепления теоретическому и достоверность различий между расщеплениями оценивали по критерию %2.
Восстановление экспрессии гена nptII оценивали у растений-регенерантов, а также у Т2-потом-ков Nu 21/6 после инкубации в течение пяти недель с ингибитором метилирования 5-азацитиди-ном. Для этого в чашки Петри с 4-6-дневными растениями (до появления гипокотиля) добавляли 100 мкМ/мл раствора 5-азацитидина. Растение Nu 21/6 было отобрано нами для проведения данного эксперимента, так как характеризовалось наиболее высокой частотой появления потомков-мозаиков при самоопылении и наиболее высоким уровнем отклонений в расщеплениях по сравнению с другими случайно отобранными девятью растениями (Nu21/1-Nu21/9). Для сравнения использовали семена, полученные из одной семенной коробочки (опыт и контроль).
Геномную ДНК из листьев табака выделяли с помощью ЦТАБ-буфера [23]. Блот-гибридиза-цию ^coRI-гидролизатов ДНК трансгенных растений проводили на нейлоновых фильтрах ("Аш-ersham", Англия) по методу Саузерна с модификациями [24]. В качестве зонда использовали ПЦР-продукт на последовательность гена nptII. Определение активности фермента NPTII in situ в экстрактах из листьев трансгенных растений табака проводили согласно стандартному протоколу [24].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характерная особенность трансгенного растения табака Nu 21 состояла в мозаичном проявлении маркерного гена nptII среди потомков первого поколения от самоопыления. Растения на 4-6-ю неделю после развития зародыша имели ярко выраженную пятнистую окраску листьев: чередование белых и зеленых секторов (рис. 2). Как видно
на представленном рисунке, белые сектора могут располагаться в различных частях листовой пластинки с четкой или размытой границей между зелеными и белыми пятнами. Необходимо подчеркнуть, что возникновение белых пятен на листовых пластинках растений наблюдалось только в условиях селективной среды, что указывало на нарушение экспрессии маркерного гена nptII в этих участках.
На рис. 3 представлены результаты анализа активности фермента NPTII in situ в экстрактах из листовых пластинок табака. На дорожках 1 и 2 (рис. 3) нанесены экстракты из тканей 6-недель-ных проростков, полученных из семян трансгенного (положительный контроль) и нетрансгенно-го (отрицательный контроль) растений, культивируемых на среде с добавлением антибиотика канамицина. Наличие полосы на дорожке 1 и ее отсутствие на дорожке 2 свидетельствуют об активности анализируемого фермента. В тканях трансгенных растений фермент проявлял активность и соответственно в тканях нетрансгенного растения, как и следовало ожидать, активность фермента не регистрировалась. На дорожках 3 и 4 нанесены экстракты из листовых фрагментов растений линии Nu21 зеленого и белого цвета соответственно. Наличие на фореграмме хорошо выраженной полосы на дорожке 3 подтверждает проявление высокой активности фермента NPTII в анализируемой ткани, тогда как наличие слабо регистрируемой полосы на дорожке 4 свидетельствует о низкой активности исследуемого фермента в ткани, соответствующей листовым фрагментам белого цвета. Следовательно, уровень активности фермента NPTII в тканях листовых пластинок растений Nu 21 различен (высокий в одних тканях и низкий в других), что и приводит к мозаичному фенотипу проявления гена nptII в условиях селективной среды. Наличие слабого сигнала на дорожке 4, вероятнее всего, связано и с методическими погрешностями, обусловленными частичным попаданием небольшого количества тканей из зеленых частей при разделении фрагментов листовых пластинок (в силу размытости границ между зелеными и белыми фрагментами). Однако это не отвергает основного заключения о том, что анализируемый фермент в тканях данного растения проявляет различную функциональну
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.