РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 9(18), № 1, с. 71-82
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
мукозальный иммунитет: активация агонистами toll-подобных рецепторов
© 2015 г. Н.К. Ахматова*, Н.Б. Егорова*, Е.А. Курбатова*, Э.А. Ахматов*, Н.П. Уткина**, Е.А. Ильиных**, О.В. Лебединская**, Е.В. Сорокина*, Е.С. Маракасова*
*ФГБУ НИИ Вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, Россия;
**ГОУ ВПО Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера Росздрава, Пермь, Россия
Поступила: 10.04.2014. Принята: 15.01.2015
Työ и В1 лимфоциты являются важнейшими компонентами мукозальной иммунной системы, отличающиеся способностью усвоения бактериальных и вирусных лигандов, без костимулирующих сигналов и предварительного процессинга другими эффекторами иммунитета. Это обстоятельство обеспечивает быструю защиту от различных патогенов и вносит свой вклад в расшифровку механизма меньшей сенсибилизирующей активности антигенов при мукозальном введении, поскольку при взаимодействии этих клеток экс-прессируются IgM и IgA антитела, но не IgE. В исследованиях подтверждено положение о том, что происходит интенсивный обмен лимфоцитами не только между лимфоидными образованиями, ассоциированными со слизистыми оболочками респираторного и желудочно-кишечного трактов, но и с селезенкой, что обеспечивает при мукозальных методах иммунизации развитие не только местного, но и системного иммунитета.
Ключевые слова: NALT/BALT, GALT, мукозальный иммунитет, TLRs, цитокины
ВВЕДЕНИЕ
Значительную роль в первичных этапах распознавания микробных антигенов, наряду с их физико-химическими свойствами, играет метод введения их в макроорганизм, определяющий набор рецепторов, взаимодействующих с лигандами микроорганизмов, и, соответственно, сигнальные пути дальнейших этапов развития активации врожденного и адаптивного иммунитета.
Теоретическими и экспериментальными исследованиями последних лет выявлено, что важнейшими компонентами, обеспечивающими особенности функциональной активности мукозальной иммунной системы, являются TyS лимфоциты и В1 лимфоциты, заселяющие эпителий слизистых оболочек, характеризующиеся способностью усвоения патоген-ассоциированных структур микроорганизмов (pathogen-associated molecular
Адрес: 105064, Москва, Малый Казенный переулок, д.5а, Ахматовой Нэлли Кимовне. E-mail: anelly@mail.ru
patterns — PAMPs) без костимуляторных сигналов и предварительного процессинга другими эффекторами иммунитета [1, 2, 3, 4].
Наряду с этими ключевыми эффекторами мукозального иммунитета в его реализации играют роль и другие иммунокомпетентные клетки, взаимодействие которых с TyS и В1 лимфоцитами обеспечивает активацию му-козальной иммунной системы и способность развития при этом не только местного, но и системного иммунитета к антигенам/патогенам [4, 5].
Среди PRRs (pattern recognition receptors) наибольшее внимание исследователей привлекают Toll-подобные рецепторы (TLRs), распознающие PAMPs различных классов патогенов, взаимодействующие с клеточными адаптерными системами и запускающими каскад передачи сигнала. Активация различных сигнальных путей обуславливает индукцию комплекса различных защитных реакций [6, 7].
Эти данные предопределяют возможность регуляции сигнальных путей, активируемых
TLRs, с помощью различных иммунтропных средств, несущих в своем составе PAMPs микроорганизмов и в связи с этим способных обеспечить определенную степень защиты от различных патогенов [7, 8].
Актуальность таких исследований очевидна, однако наименее изученными остаются молекулярно-клеточные механизмы активации врожденного и адаптивного иммунитета при мукозальных методах введения иммуно-модуляторов и вакцин.
Для изучения особенностей мукозального иммунитета в данной работе использована поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4, обладающая широким набором PAMPs, что обусловливает высокую активность этого препарата в отношении врожденного иммунитета, установленную на молекулярно-клеточном уровне при подкожном введении мышам [9] и на различных инфекционных моделях [10].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Препараты
Поликомпонентная вакцина Иммуно-вак-ВП-4® (ФГУП «НПО «Микроген») из антигенов условно патогенных микроорганизмов (Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli и Staphylococcus aureus) предназначена для иммунотерапии хронических воспалительных и аллергических заболеваний. Вакцина содержит ЛПС, ассоциированный с белком наружной мембраны грамотри-цательных микроорганизмов, пептидогликан, тейхоевые кислоты, липопротеины, являющиеся лигандами для Толл-подобных рецепторов (Toll-like receptors — TLRs).
Экспериментальные животные
Использованы мыши линий СВА, 16—18 г, полученные из питомника НЦ Биомедицинских технологий РАМН «Андреевка», содержащиеся в условиях вивария НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Выделение мононуклеарныхлейкоцитов (МЛ)
Мононуклерные лейкоциты лимфоидных органов мышей (МЛ) выделяли с помощью
одноступенчатого градиента плотности фи-колл-урографина по методу [11].
Определение экспрессии поверхностных маркеров и TLRs проводили при помощи мо-ноклональных антител («Caltag Laboratories», США) против соответствующих антигенов. Результаты учитывали на проточном цито-метре FacsCalibur («Beckman Coulter F-500», США). На МЛ селезенок мышей, лимфатических узлов и слизистой оболочке тонкого кишечника исследовали уровни экспрессии CD3, NK 1,1, CD3/NK, CD4, CD25, CD4/CD25, CD8, CD 19, MHC II класса, CD5,2, TCR(TyS), TLR2,4,9.
Цитотоксическую активность МЛ лимфоидных органов мышей определяли на NK чувствительной линии клеток опухоли К-562. Опухолевые клетки (3*104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде (RPMI-1640, содержащей 2 mM Glutamine, 5% ЭТС, 1% бензилпенициллина натриевой соли) с МЛ в соотношении 1:5 в плоскодонных 96-луноч-ных планшетах 18 часов в СО2 — инкубаторе при 37 °С и 4% СО2. Затем в лунки добавляли витальный краситель МТТ («Fluka») и по оптической плотности при X 540 нм, измеряемой на мультискане МБ («Labsystem», Финляндия), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цитотоксичности).
Определение уровня цитокинов
Цитокины в сыворотках крови мышей определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем фирмы Bender MedSystems (США) согласно инструкции производителя.
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Excel (Microsoft Corporation, США), интегрированным пакетом статистического анализа StatSoft 8,0 с применением параметрических и непараметрических методов сравнения.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На первом этапе исследований было изучено влияние Иммуновак-ВП-4 на экспрессию Toll-подобных рецепторов в селезенке и в лимфоузлах, ассоциированных с органами дыхания и желудочно-кишечным трактом при различных методах иммунизации этим препаратом.
Таблица 1. Содержание TLRs у интактных мышей,
№ опыта Исследованные органы Количество клеток, экспрессирующих TLRs,%
TLR2 TLR4 TLR9
1 Селезенка 0,05±0,02 0,1±0,04 0,1±0,03
2 // - // 0,04±0,03 0,09±0,07 0,09±0,03
1 NALT/BALT 0,2±0,03 0,04±0,4 0,04±0,01
2 // - // 0,22±0,14 0,01±0,01 0,04±0,03
1 GALT 0,38±0,05 0,3±0,04 0,3±0,2
2 // - // 0,5±0,15 0,2±0,06 0,23±0,13
NALT — Nasal Associate Lymphoid Tissue, назально/бронхоассоциированная лимфоидная ткань.
BALT — Bronco Associate Lymphoid Tissue, бронхоассоциированная лимфоидная ткань.
GALT — Gut Associate Lymphoid Tissue, лимфоидная ткань, ассоциированная с тонким кишечником.
В приведенных ниже исследованиях мышам подкожным, интраназальным или перо-ральным методами вводили Иммуновак-ВП-4. Мукозальную иммунизацию проводили
1-кратно или 3-кратно с интервалом 2 — 3 дня. Назально препарат вводили в разовой дозе 500 мкг в объеме 30 мкл. Пероральная разовая доза составила 2000 мкг в объеме 0,5 мл. Подкожно препарат вводили 1-кратно и
2-кратно с интервалом 7 суток дозой 200 мкг на каждое введение. Через сутки после последнего введения вакцины мышей выводили из опыта эфирным наркозом, извлекали селезенку, лимфатические узлы, ассоциированные с носовой полостью и бронхами (Nasal Associate Lympoid Tissue — NALT, Broncho Associate Lympoid Tissue — BALT) и с тонким кишечником (Gut Associate Lympoid Tissue — GALT).
У иммунизированных мышей определяли количество мононуклеарных лейкоцитов, экспрессирующих TLRs. Полученные результаты оценивали по проценту клеток, экспрессирующих TLR2, TLR4 и TLR9. Уровень экспрессии TLRs лимфоидными органами интактных мышей по данным 2-х опытов был небольшим и колебался от (0,01 до 0,5)%. Важно, что в 2-х опытах получены практически однозначные результаты, которые, видимо, можно принять за норму для интактных мышей (табл. 1).
У мышей, вакцинированных 1-кратно инт-раназально в исследованной дозе, число клеток, экспрессирующих исследованные TLRs существенно не увеличивалось (рис. 1). При пероральном однократном введении вакцины было отмечено значительное увеличение TLR4 и TLR9 в GALT до (5,2±0,5 и 4,6±0,3)%
%
6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1
0,5 0
12 3 12
Интраназальный метод Пероральный метод
1 - селезенка; 2 - NALT/B ALT; 3 - GALT
Подкожный метод
Рис. 1. Содержание То11-подобных рецепторов при разных методах введения (однократное введение). РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 9(18), № 1
%
14,9 ± 1,5
Н.К. Ахматова и др. 12 ± 1,8
6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1
0,5 0
яь
пя
i=
11,3 ± 0,8
13,2 ± 1,8
□ TLR2
□ TLR4 ■ TLR9
Y
12 3 12 3
Интраназальный метод Пероральный метод
1 - селезенка; 2 - N ALT/B ALT; 3 - GALT
12 3
Подкожный метод
Рис. 2. Содержание То11-подобных рецепторов при 3-х кратном введении мукозальным и 2-кратном подкожным методами.
соответственно, а также TLR9 до (1,2±0,3)% в NALT/BALT. В селезенке существенных сдвигов при этом методе введения не было.
Распределение TLRs при подкожном однократном введении 200 мкг того же препарата было иным. В этом случае отмечали значительное увеличение уровня TLR2 (3,4±0,3)% и TLR4 (1,2±0,06)% в селезенке и увеличение до
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.