ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 5, с. 475-480
УДК 577.15
МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫИ БИОРЕАКТОР НА ОСНОВЕ КОМПЛЕКСА ХИТИНАЗ © 2014 г. Е. Г. Влах***, Е. А. Пономарёва*, Т. Б. Тенникова***
*Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук, Санкт-Петербург 199004 **Санкт-Петербургский государственный университет, Институт химии, Санкт-Петербург 198504
e-mail: tennikova@mail.ru Поступила в редакцию 05.11.2013 г.
Получен гетерогенный биокатализатор, содержащий на поверхности макропористого монолитного минидиска комплекс хитинолитических ферментов, выделенных из культуральной среды бактерий Clostridium paraputrificum. Комплекс хитинолитических ферментов был совместно иммобилизован на полимерной матрице многоступенчатым методом, включающим введение промежуточного мак-ромолекулярного спейсера. Проведено изучение эндохитиназной и N-ацетилглюкозаминидазной активности гетерогенного биокатализатора.
DOI: 10.7868/S0555109914050146
Хитиназы используются в биотехнологии при производстве хитоолигосахаридов и М-ацетил-Э-глюкозамина, а также для переработки отходов хитина [1]. Известно, что в процессе деградации хитина участвуют несколько хитинолитических ферментов, представляющих собой гликозид гидролазы, расщепляющие Р-1,4-гликозидные связи в молекулах хитина и различающиеся значениями изоэлектрических точек и молекулярных масс [2, 3]. Эндохитиназа и хитозаназа гидролизуют хитин с образованием олигомеров различной длины. Образующиеся хитоолигосахариды под действием Р-М-ацетилглюкозаминидазы и экзохитиназы, а также деацетилазы полностью расщепляются до мономерного звена — глюкозамина [4]. Хитиназы встречаются как у насекомых, ракообразных, в дрожжах и грибах, так и в тех организмах, которые не содержат хитин, например в бактериях, у высших растений и позвоночных животных [5].
В настоящее время очищенные и полуочищенные хитиназы получают из микроорганизмов [6]. В этом случае очистка хитинолитических ферментов обычно осуществляется с использованием многостадийной схемы, включающей центрифугирование, необходимое для удаления бактериальных клеток, ультрафильтрацию через соответствующие мембраны или гель-фильтрацию полученного супернатанта и, наконец, многоступенчатый цикл очистки методами ионообменной хроматографии [7—10].
Использование гетерогенных биокатализаторов, т.е. ферментов, иммобилизованных на поверхности твердой фазы [11], относится к наиболее удобным и экономичным подходам при биоконверсии различного сырья. Это обусловлено, в первую очередь тем, что локализация фермента
на твердом сорбенте способствует стабилизации его конформации, препятствуя, таким образом, денатурации и падению каталитической активности [11], а также облегчает отделение продуктов реакции и делает возможным многократное использование биокатализатора.
В настоящее время разработаны различные методы иммобилизации ферментов [11]. Иммобилизацию можно осуществлять путем физической адсорбции биомолекул на поверхности твердого носителя, включения (инкапсулирования) в носитель, а также ковалентного связывания белка с поверхностью носителя, благодаря присутствию реакционноспособных групп. Ковалентная иммобилизация фермента на поверхности твердой фазы позволяет сохранить стабильность структуры гетерогенного биокатализатора. Известно, что физическая и химическая природа матрицы, а также тип химической связи играют определяющую роль в сохранении активности фермента, присоединяемого к нерастворимому носителю. Это обусловливает важность выбора твердой фазы для продуктивного использования каталитической функции фермента.
Использование проточных систем, в которых в условиях постоянного потока жидкость проходит через твердую фазу, позволило создать хромато-графические реакторы, когда каталитический процесс происходит в динамических условиях [12]. Подобные проточные системы включают стационарную фазу с иммобилизованным на ее поверхности биокатализатором, насос, обеспечивающий поток реакционной смеси, а также детектор для регистрации изменений, происходящих в системе. В качестве стационарной фазы для создания хроматографических реакторов обычно
использовались разнообразные дисперсионные (мелкочастичные) сорбенты различной природы [13—15], при этом в колонках создавался, так называемый, "пустой объем" (межчастичное пространство). Введение стационарных сред в виде монолитных макропористых материалов позволило минимизировать этот нежелательный объем, где вся подвижная фаза с растворенным в ней веществом протекает через слой сорбента [16]. В отличие от колонок с частицами сорбента, в которых массоперенос контролируется процессом диффузии вещества в поры стационарной фазы, в монолитах при высоких скоростях подвижной фазы преобладает конвективный механизм мас-сопереноса. Системы с иммобилизованным про-теолитическим ферментом, трипсином, используемые для получения пептидных карт, являются типичным примером гетерогенных биокатализаторов, основанных на использовании монолитных сорбентов [17].
Как правило, ковалентная иммобилизация ферментов на поверхности монолитных матриц осуществляется либо прямыми методами [18], либо с использованием таких коротких спейсеров [19], как глутаровый альдегид или гексаметилен-диамин. Однако существует метод ковалентной иммобилизации ферментов, основанный на использовании полимерных спейсеров [20].
Цель работы — иммобилизация комплекса хи-тинолитических ферментов бактерий Clostridium paraputrificum J4 на поверхности ультракоротких монолитных колонок (дисков) многостадийным методом с использованием водорастворимого альдегид-содержащего полимерного спейсера и изучение его эндохитиназной и N-ацетилглюко-заминидазной активности.
МЕТОДИКА
N-ацетил-Э-глюкозамин, 4-нитрофенил^-ацетил-Р-Э-глюкозаминид и гидразид 4-гид-роксибензойной кислоты — продукты фирмы "Sigma-Aldrich" (Германия). Соли, кислоты и щелочи аналитической степени чистоты, использованные для приготовления растворов, а также 25%-ный раствор аммиака — "Вектон" и "Нева-Реактив" (Россия). Макропористый монолитный диск "CIM Epoxy minidisk" и соответствующий стальной картридж были любезно предоставлены фирмой "BIA Separations" (Словения). Комплекс хитиназ был получен из Института макромолеку-лярной химии Академии наук Чешской Республики [21].
Хроматографическая система низкого давления включала насос "Masterflex Console Drive Easy-Load II Model 77201-60" (США) и УФ-детек-тор "2138 Uvicord S" (Швеция). Температуру (40 ± ± 1°C) поддерживали, используя термостат для
колонок "Eppendorf" (Германия). Оптическую плотность анализируемых растворов определяли спектрофотометрически на "UVmini-1240 Shimad-zu" (Япония). Для построения кривых Михаэлиса и их линеаризованных форм использовали программу "Origin 6.0". Коэффициенты R2 лежали в пределах 0.985—0.998. Гель-электрофорез проводился по методике, приведенной в работе [21].
Иммобилизация комплекса хитиназ. На первой стадии полимерный диск инкубировали в 5 мл 25%-ного раствора аммиака в течение 5 ч при 40° C для аминирования сорбента. На второй стадии полученный сорбент инкубировали в 1 мл раствора (0.65 мг/мл) окисленного полимера 2-деокси-N-меткарилоиламидо-Э-глюкозы (пМАГ) в 0.01 М Na-фосфатном буфере, рН 7.0, в течение 1.5 ч при 22°C. На третьей стадии сорбент инкубировали в 1 мл раствора, содержащего 2 мг/мл комплекса хитиназ в 0.01 М Na-боратном буфере, рН 8.4, в течение 1.5 ч при 22°C. На последней стадии проводили восстановление образовавшихся иминных связей раствором боргидрида натрия (2 мг/мл) в воде в течение 1 ч при температуре 22°C.
После каждой стадии полимерную матрицу в течение 10 мин промывали 0.01 M Na-фосфат-ным буфером, рН 7.0, при скорости подвижной фазы 0.5 мл/мин. Количество иммобилизованного фермента рассчитывали по разнице содержания белка в растворе до и после иммобилизации. Количество белка определяли по методу Лоури— Фолина [22].
Гидролиз хитоолигосахаридов. Гидродиз осуществляли, пропуская раствор субстрата (1 мг/мл) в 0.1 Na-фосфатном буфере, pH 6.0, через слой стационарной фазы с иммобилизованным комплексом хитиназ. Реакцию проводили в течение 15 мин при 40°C со скоростью рециркуляции раствора субстрата 0.5 мл/мин.
Гель-проникающая хроматография. Анализ продуктов гидролиза хитоолигосахаридов проводили на колонке (320 х 10 мм) с сефадексом G-75. Объем геля (Vt ) составлял 25 мл, свободный объем (Vo) — 7.5 мл. В качестве подвижной фазы использовали воду. Объем анализируемой зоны составлял 0.3 мл. Анализ проводили при скорости подвижной фазы 0.3 мл/мин. Оптическую плотность элюата определяли при 226 нм.
Определение эндохитиназной активности в растворе. В качестве субстрата использовали раствор карбоксиметилхитина (0.5—3.0 мг/мл) в 0.1 Na-фосфатном буфере, pH 6.0. К 0.3 мл раствора субстрата, определенной концентрации, добавляли 0.1 мл комплекса хитиназ (2 мг/мл). Полученную смесь инкубировали в течение 60 мин при 40°C. Реакцию останавливали последовательным добавлением 0.4 мл 0.3 M ZnSO4 и 0.4 мл 0.3 M Ba(OH)2. Осадок отделяли центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин. К 0.1 мл супернатанта
МУЛЬТИФЕРМЕНТНЫЙ БИОРЕАКТОР НА ОСНОВЕ КОМПЛЕКСА ХИТИНАЗ
477
%
30 25 20 15 10 5
CH
3
CH3
26
28
12
21
38
44
59 кДа
60
69
^h2C—с4
k
C=O
I
NH H
H2C—C-
C=O
I
NH
OH
H
CH2OH
H.OH
O
O
CH2OH
Рис. 1. Содержание основных компонентов (%) комплекса хитиназ, использованного для получения проточного гетерогенного биокатализатора, и их молекулярные массы.
добавляли 0.2 мл воды, 0.72 мл 0.5 М №ОН и 0.18 мл 5%-ного раствора гидразида 4-гидрокси-бензойной кислоты в 0.5 М НС1. Полученную смесь инкубировали в закрытых пробирках в течение 10 мин при 100°С. Оптическую плотность смеси измеряли в кварцевых кюветах (0.5 см) при 410 нм. Концентрацию продукта рассчитывали по калибровочной кривой, построенной для М-ацетил-Э-глюкозамина.
Определение эндохитиназной активности гетерогенного биокатализатора. 1.5 мл раствора карбоксиметилхитина (0.2—1.2 мг/мл) пропускали в режиме рециркуляции через слой стационарной фазы с иммобилизованным комплексом хитиназ. Скорость подвижной фазы состав
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.