научная статья по теме МУСКАРИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ АЦЕТИЛХОЛИНА ВКУСОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ Биология

Текст научной статьи на тему «МУСКАРИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ АЦЕТИЛХОЛИНА ВКУСОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ»

УДК 577.3

МУСКАРИНОВЫЕ РЕЦЕПТОРЫ АЦЕТИЛХОЛИНА ВКУСОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ

© 2010 г. О. А. Рогачевская, Р. А. Романов, Ю. Е. Яценко, С. С. Колесников

Институт биофизики клетки РАН, 142290Пущино Московской обл., Институтская, 3; факс: 8-(4967)-33-0509;

электронная почта: olga_rog@rambler.ru Поступила в редакцию 07.05.2009 г.

Гетерогенная популяция клеток вкусовой почки млекопитающих включает клетки различных мор-фотипов (тип I, тип II, тип III), выполняющие различные физиологические функции. Ряд фактов свидетельствует о том, что эти клетки используют несколько сигнальных систем для межклеточных коммуникаций, которые обеспечивают функционирование вкусовой почки как единого органа. В частности, во вкусовой ткани идентифицированы рецепторы ряда классических нейротрансмитте-ров/нейромодуляторов. Все эти рецепторы и их агонисты могут быть вовлечены в межклеточные коммуникации, хотя их роль в физиологии вкусовой почки окончательно не установлена. В представленной работе мы выясняли функционирует ли холинергическая система во вкусовых почках мыши, и если да, то какие типы вкусовых клеток функционально экспрессируют рецепторы ацетил-холина. Вкусовые клетки идентифицировали электрофизиологически, стимулировали негидроли-зуемым аналогом ацетилхолина — карбахолом, и их чувствительность к агонисту преимущественно оценивали по вызываемым Са2+ сигналам. Карбахол мобилизовал Са2+ в цитоплазме вкусовых клеток типа I и был неэффективен в случае клеток типа II и типа III. Клетки отвечали на карбахол в широком диапазоне концентраций, в среднем показывая ЕС50 = 2.5 мкМ. Ответы вкусовых клеток на агонист наблюдались при снижении наружного Са2+ до 100 нМ и полностью подавлялись в присутствии 1 мкМ атропина — антагониста мускариновых рецепторов. Этот факт, а также то, что никотин не стимулировал Са2+ сигнализацию во вкусовых клетках всех типов, свидетельствует о доминирующей роли мускариновых рецепторов в карбахол-зависимой мобилизации внутриклеточного Са2+. Специфический антагонист М^рецепторов телензепин подавлял ответы на карбахол лишь частично, а ответы на специфический агонист М^рецепторов МсМ-Л-343 были существенно меньше Са2+ ответов на карбахол. Эти данные показали, что вкусовые клетки мыши экспрессируют М^рецепто-ры, однако рецепторы других типов, М3- и/или М5-рецепторы, вносят основной вклад в генерацию Са2+ ответов на карбахол. Анализ экспрессии генов, кодирующих мускариновые рецепторы, методом ОТ-ПЦР выявил в препарате вкусовой ткани транскрипты рецепторов М^ М3 и М5. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что только вкусовые клетки типа I экспрессируют активные мускариновые рецепторы нескольких типов, которые сопряжены с фосфоинозитид-ным каскадом.

Ключевые слова: мускариновые рецепторы, Са2+-сигнализация, вкусовые клетки, ОТ-ПЦР.

Вкусовая почка млекопитающих представляет собой ассоциат нескольких десятков веретенообразных клеток, принадлежащих к различным морфотипам (тип I, тип II, тип III) и выполняющих различные физиологические функции [1]. Физиологические и молекулярно-биологические данные свидетельствуют о том, что во вкусовой почке функционирует несколько сигнальных систем. В частности, идентифицированы рецепторы таких классических нейротрансмиттеров/ней-ромодуляторов, как глутамат, серотонин, ГАМК (у-аминомасляная кислота), АТР, норадреналин, холецистокинин, нейропептид Y [2, 3]. Хотя потенциально все эти рецепторы и их агонисты могут быть вовлечены в межклеточные коммуникации во вкусовой почке, окончательно не установлено, какие физиологические процессы

протекают при участии конкретной сигнальной системы, и почему периферическая вкусовая система нуждается в столь большом количестве разных сигнальных молекул. Отчасти этот феномен может объясняться тем, что клеточная популяция вкусовой почки быстро и постоянно изменяется. Вкусовые клетки обмениваются примерно 1 раз в 2 недели, развиваясь из базальных клеток — клеток-предшественников — и в конце жизни подвергаясь апоптозу [1]. Их непрерывное обновление требует, в частности, постоянного установления новых синаптических связей во вкусовой почке. Кроме того, подобно тому, как это происходит в сетчатке или обонятельной луковице, сенсорная информация может подвергаться первичной обработке во вкусовой почке. Протекание всех этих гетерогенных процессов несомненно

требует синхронизации и, следовательно, хорошо отлаженных коммуникаций между клетками вкусовой почки, которые, вероятно, невозможно осуществлять с привлечением лишь одной сигнальной системы.

Недавно в экспериментах на неидентифици-рованных вкусовых клетках крысы было показано, что ацетилхолин мобилизует внутриклеточный кальций в субпопуляции этих клеток, и, как свидетельствовали фармакологические данные и данные иммуногистохимии, Са2+-ответы на внеклеточный ацетилхолин могут генерироваться при участии мускариновых рецепторов типа М1 [4]. Основная цель данной работы состояла в выяснении функционирования холинергической системы во вкусовых почках мыши, и если да, то какие типы вкусовых клеток экспрессируют рецепторы ацетилхолина.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Выделение вкусовой ткани, вкусовых почек и клеток. Использовали следующую методику [5]. Смесь протеолитических ферментов (0.9 мг/мл коллагеназы Б, 1.2 мг/мл диспазы II, оба "Boe-hringer Mannheim" (США) и 0.5 мг/мл ингибитора трипсина "Sigma" (США), растворенных в среде (мМ): 120 NaCl, 20 KCl, 1 MgCl2, 0.5 CaCl2, 10 HEPES-NaOH (pH 7.4), инъецировали в удаленный язык максимально близко к эпителиальному слою. Язык инкубировали в течение 25— 30 мин при температуре 25°С в бескальциевом растворе, содержащем (мМ) 130 NaCl, 10 KCl, 1.1 MgCl2, 1 EGTA, 1 EDTA, 10 HEPES-NaOH, 10 глюкозы (pH 7.4). Такая обработка позволяла отделить языковый эпителий с прикрепленными вкусовыми почками от мышечной ткани. Отделенный эпителий прикреплялся в чашке Петри наружной стороной вниз так, чтобы вкусовая ткань была доступна для дальнейших манипуляций. Эпителий инкубировали в бескальцевом растворе в течение 20—30 мин, затем раствор заменяли на внеклеточный раствор следующего состава (мМ): 130 NaCl, 10 NaHCO3, 5 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES-NaOH, 5 глюкозы, 2 Na-пиру-вата (pH 7.4). Вкусовые почки и клетки вытягивали из вкусовой ткани с помощью стеклянной пипетки с диаметром кончика 70—90 мкм и помещали в перфузируемую электрофизиологическую камеру, описанную ранее [6].

Электрофизиология. Электрическую активность вкусовых клеток регистрировали методом perforated patch-clamp с применением усилителя Axopatch 200 B, ЦАП-АЦП конвертера DigiData 1200 и пакета лицензионных программ pClamp8.0, все "Axon Instruments" (США). Базовый внеклеточный раствор содержал (мМ): 140 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES-NaOH, 10 глюкозы (pH 7.4). В ряде эксперимен-

тов наружные растворы содержали 1 мМ EGTA и 0.3 мМ Ca2+ (концентрация свободного Ca2+ — 100 нМ). Использовали внутриклеточный раствор (мМ): 140 CsCl, 1 MgCl2, 0.1 EGTA, 10 HEPES-CsOH, 200 мкг/мл амфотерицина Б (pH 7.4). Соли, EGTA, EDTA, HEPES, амфоте-рицин были производства фирмы "Sigma" (США), остальные препараты — фирмы "Calbio-chem" (США). Мембранные потенциалы были скорректированы с учетом поправки на диффузионный потенциал. Исследования проводили при температуре 18—22°C.

Фотометрия. Изменения цитозольного Са2+ во вкусовых клетках визуализировали при помощи lCCD-камеры IC-200, "Photon Technology International" (США), используя микроскоп Axio-scope-2 и водно-иммерсионный объектив Achro-plan-40, NA = 0.8 "Carl Zeiss" (Германия). Клетки загружали 2—4 мкМ Fura-2AM или Fluo-4 в течение 25 мин в присутствии 0.02% pluronic (реактивы "Molecular Probes" (США)) при комнатной температуре. Флуоресценцию возбуждали светом 340/380 нм при помощи осветителя на сверхярких излучающих полупроводниковых диодах [7]. Излучение эмиссии фильтровали при помощи интерференционного фильтра (510 ± 20 нм) "Chroma" (США). Последовательные флуоресцентные изображения клеток или их интегральную эмиссию регистрировали каждые 0.5—2 с при помощи программы Imaging Workbench 5.2 "INDEC Biosystems" (США). Эксперименты проводились при температуре 22—25°C.

ОТ-ПЦР. Суммарную РНК выделяли из желобоватых сосочков языка и из головного мозга мыши с помощью набора RNeasy Mini kit "Qiagen" (США), следуя инструкции производителя. Для синтеза первой цепи кДНК использовали обратную транскриптазу SuperScriptIII "Invitrogen" (США) и олиго^^-праймер. Для амплификации специфических участков кДНК мускариновых рецепторов методом ПЦР использовали три пары ген-специфических праймеров (5'-GATCTCAT-CATTGGCACTTTCTCC-3' и 5'-CTTGTC-CCAGCGGCAGA-3'; 5'-AACTCTACCAAGC-TACCCTCC-3' и 5'-AGGTGGTTCTGAATGTCT-TGTTG-3'; 5'-CAAAGAGGGCTGGCATCA-3' и 5'-ATTTTCACCTTACGACAGCCATT-3'), соответствующих участку гена рецептора М1 от 736 до 1843 размером 1107 п.н., М3-рецептора — от 1915 до 2443 размером 529 п.н. и М5-рецептора от 431 до 1205 размером 775 п.н. Праймеры конструировали на основании нуклеотидных последовательностей NM_007698, NM_033269 и NM_205783, представленных в базе данных GenBank.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Вкусовые клетки выделяли из желобоватого вкусового сосочка мыши и их чувствительность к

Карбахол, мкМ: 10

0.5

50

5 мин

ДСа2+ 100 нМ

и йиииищцттцм!

10 мкМ ATP 10 мкМ карбахол

Mm if^

50 с

100 пА

0.01 0.1 1 10 100 1000 Карбахол, мкМ

Рис. 1. Изменение концентрации свободного Са2+ в цитоплазме вкусовых клеток в ответ на аппликацию карбахола. а — Са2+-ответы, полученные на одной клетке при разных концентрациях карбахола во внеклеточной среде. Начало и длительность аппликации агониста указаны горизонтальными линиями над экспериментальной кривой. б — Зависимость амплитуды ответа (•) от концентрации агониста. За величину ответа принимали разность между внутриклеточной концентрацией свободного Са2+, измеряемой в пике и непосредственно перед аппликацией карбахола, соответственно. Данные представлены как среднее ± среднеквадратичная ошибка. Для усреднения данных, полученных в различных экспериментах (n = 27), величину Са2+-ответа на аппликацию 10 мкМ карбахола

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком