БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 5, с. 990-994
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ =
УДК 57.02: 57.044: 575.224.46.044
МУТАГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ В ТЕСТЕ ЭЙМСА ЧЕТЫРЕХ АМИНОАЗОСОЕДИНЕНИЙ С РАЗЛИЧНОЙ КАНЦЕР ОГЕННОСТЬЮ ДЛЯ ПЕЧЕНИ КРЫС
© 2015 г. Т.С. Фролова* **, О.И. Синицына***, В.И. Каледин***
*Новосибирский государственный университет, 630090, Новосибирск, ул. Пирогова, 2; **Новосибирский институт органической xимии им. Н.Н. Ворожцова CО РАН, 630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 9; ***Институт цитологии и генетики CО РАН, 630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 10
E-mail: kaledin@bionet.тс.ru Поступила в p едакцию 05.05.15 г.
Сопоставлена мутагенность в бактериальном тесте Эймса с использованием для активации печеночных ферментов крыс четырех аминоазосоединений, изученных ранее другими исследователями в отношении канцерогенности для печени крыс. Оказалось, что в условиях теста все они проявляют мутагенную активность, которая, однако, количественно не коррелирует с чувствительностью крыс к их гепатоканцерогенному действию. Так, наиболее активный канцероген 3'-метил-4-диметиламиноазобензол вызывает почти в 2,5 раза меньше мутаций, чем слабоканцерогенный орто-аминоазотолуол, и ровно столько же, сколько совсем неканцерогенный ^!Ч-диэтил-4-аминоазобензол.
Ключевые слова: мутагенез, гепатоканцерогенез, аминоазосоединения, бактериальные тесты.
В теоретической и экспериментальной онкологии вся вторая половина XX века пр ошла под знаком изучения взаимодействия канцеро -генов с клеточной ДНК. Широкая популярность представлений о канцерогенезе как о ге-нотоксическом процессе, обещавших незамедлительную расшифр овку его механизма, оправдывалась также заманчивой возможностью ускоренного выявления опасных в канцерогенном отношении веществ в краткосрочных тестах на мутагенность. И хотя между канцерогенной активностью химических соединений и их мутагенностью в этих тестах имеется статистическая корреляция, однозначного соответствия между ними нет. Причиной этого может быть несо-ответствие между условиями метаболизма со -единения в ткани, в которой оно вызывает опухоли, и в тесте на мутагенность, в котором для его активации используются почти исключительно ферменты печени крыс. В предыдущей работе [1] нами было показано, что пр и однократном введении в подсосном периоде 3'-ме-тил-4-диметиламиноазобензол (3'-Ме-ДАБ) ин-дуцир ует у мышей значительно больше опухо -
Сокращения: 3'-Ме-ДАБ - 3'-метил-4-диметиламиноазо-бензол, ДАБ - К,1Ч-диметил-4-аминоазобензол, ДЭБ -К,1Ч-диэтил-4-аминоазобензол, 2-ААФ - 2-ацетиламино-флуорен.
лей и предопухолевых узелков в печени, чем орто-аминоазотолуол, тогда как в бактер иаль-ном тесте на мутагенность орто-аминоазотолу-ол проявляет более высокую активность по сравнению с 3'-Ме-ДАБ. Наши результаты получены, однако, при использовании уникальной модели, а именно подсо сных мышат на стадии формирования у них дефинитивной стр уктуры печени, когда однократного воздействия канцерогеном оказывается достаточно для инициации в ней канцерогенного процесса. Между тем для индукции опухолей печени у взро слых осо -бей тр ебуется обычно вводить канцер оген хро -нически (крысам около 3 мес. и более). Поэтому представлялось необходимым выяснить, как со -относятся результаты, получаемые на подсосных мышатах, с соответствующими эффектами канцерогенов при индукции опухолей у взрослых особей. В представленной работе в классическом тесте Эймса с использованием для активации клеточных ферментов печени крыс мы изучили мутагенную активность четырех аминоазосоединений, изученных ранее другими авторами в отношении канцерогенности для этих животных.
Таблица 1. Сравнительная канцерогенность для печени крыс ДАБ, 3'-Ме-ДАБ и орто-аминоазотолуола при хроническом скармливании их животным с пищей (по литературным данным [3,4])
Параметр ДАБ 3'-Ме-ДАБ орто-аминоазотолуол
Суточная доза, мг 5,0 6,4 10
Время скармливания, сут 90 90 300
Общая доза, г (мМ) 0,45 (2,0) 0,58 (2,3) 3,0 (12,2)
Частота индукции опухолей печени, % 50,0 87,5 24,7
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Почти cp азу после открытия канцерогенно-сти аминоазокрасителей в середине прошлого века Дж. и Е. Миллеры [2] с помощью разра-ботанной ими методологии количественно оценили ее у целого ряда производных аминоазо-бензола. Все исследования проводили на крысах, которым канцерогены скармливали хр они-чески в течение трех-четырех месяцев, после чего в течение еще двух месяцев содер жали на диете без канцерогенов. Со стояние печени у каждой крысы после окончания периода скармливания канцерогена исследовали при помощи лапаротомии, а по окончании опыта - на аутопсии. При определении канцерогенной активности соединения учитывали его разовую дозу, фактическую длительность скармливания и общую дозу, а также процент развившихся опухолей и время их появления. В каждом эксперименте в качестве положительного контроля использовали К,К-диметил-4-аминоазо-бензол (ДАБ), активность котор ого принимали равной шести. В сравнении с ним канцерогенная активность 3'-Ме-ДАБ составляла 10-12 единиц, в то время как у К,К-диэтил-4-аминоазобензола (ДЭБ) она была нулевой [2]. Канцерогенность для крыс орто-аминоазотолуола Дж. и Е. Миллеры не изучали, но такая работа была про -делана независимо от них другими исследователями [3]. В настоящей работе помимо 3'-Ме-ДАБ и орто-аминозотолуола для изучения нами были взяты ДАБ и ДЭБ. Все препа раты были получены из КосЬ-Light Laboratories Ltd (Великобритания) и ICN (США). Литературные данные об их канцерогенной активности для печени крыс суммированы нами в табл. 1. Из этих данных видно, что орто-аминоазотолуол является канцерогеном для печени крыс, но значительно уступает в этом отношении не только 3'-Ме-ДАБ, но и ДАБ.
Оценку мутагенной активности указанных соединений мы пр оводили на бактериях Salmonella typhimurium штамма TA98, несущего мутацию в гистидиновом опер оне, в стандар тном твердофазном варианте теста Эймса [4] с ис-
пользованием для активации фракции S9 печени крыс, индуцированных ароклором 1254. Препарат (SUPELCO, Sigma-Aldrich, СШA) вводили самцам Вистар массой 180 г, полученным из вивария Института цитологии и генетики С О РАН, в бр юшную полость однократно в дозе 500 мг/кг массы тела. Через пять суток животных умерщвляли декапитацией, печень перфузировали холодным буфером (1,15 M KCl, 20 мМ тр ис-HCl, рН 7,4) и гомогенизировали в трех объемах этого буфер а, после чего го-могенаты центрифугировали при 9000 g в течение 15 мин. Супернатанты (фракцию S9) в стерильных ампулах хранили до использования при температуре -70°С.
Поскольку помимо канцерогенной активности изучаемые нами аминоазокрасители могли различаться между собой и по токсичности для бактерий, используемых для тестирования, в предварительных экспериментах мы подобрали такие их концентрации, при которых они проявляют максимальную мутагенную активность. Во всех случаях (за одним исключением) последняя линейно увеличивалась с увеличением дозы препаратов примерно до 15-20 мкг на чашку, а при дальнейшем увеличении снижалась, очевидно, вследствие токсического влияния на бактерии.
До постановки теста Эймса бактерии Salmonella typhimurium TA98 хранили в жидком азоте как замороженную культуру с добавлением 10% диметилсульфоксида. Для экспериментов стоки бактерий высевали на чашки с минимальным глюкозным агаром, гистидином и ампициллином (так называемые «мастер»-чашки). Для постановки теста отдельную колонию с «мастер»-чашки инокулировали в 5 мл LВ-бульона с 50 мкг/мл ампициллина и инкубировали при 37°С в течение 15-16 ч. И сходная концентрация бактерий ночной культуры штамма ТА98 составляет примерно (1-2)-108 клеток/мл. В тест-системе Эймса мы применяли метод двухслойного агара [5]. Нижний слой содержал 1,5% агара на минимальной среде М9, содержащей 20% глюкозы и 50 мг/мл ампициллина. Для верхнего слоя готовили 100 мл 0,6%-го топ-агара в физиологическом растворе
Таблица 2. Мутагенная активность изученных производных 4-аминоазобензола в тесте Эймса с использованием бактерий S. 1урЫтыпыт ТА98 без метаболической активации и с активацией ферментами Б9-фракции печени крыс, индуцированных ароклором 1254
Уединение Число ревертантных колоний при дозе препаратов на чашку
15 мкг 50 мкг
Без метаболической активации
20 ± 3
19 ± 3
21 ± 3
20 ± 4
C метаболической активацией
ДАБ 44 ± 7 16 ± 3
ДЭБ 54 ± 6 36 ± 5
3'-Ме-ДАБ 53 ± 5 28 ± 5
орто-аминоазотолуол 129 ± 16 160 ± 21
Примечание. В качестве положительных контролей использовали 4-нитрохинолин-1-оксид (в концентрации 0,3 мкг на чашку) и 3,4-бенз(а)пирен (2,5 мкг на чашку). 4-нитрохинолин-1-оксид давал 161 ± 32 колоний, бен(а)пирен в системе без активации - 26 ± 4 колоний, а в системе с активацией - 98 ± 15 колоний на чашку. В негативном контроле (с добавлением диметилсульфоксида) было по (22 ± 2)-(24 ± 3) ревертантных колоний на чашку. На каждую точку использовали шесть чашек.
ДАБ ДЭБ 3'-Ме-ДАБ орто-аминоазотолуол
NaCl, в который добавляли 10 мл 0,5 мМ раствора гистидин-биотина. После расплавления его разливали в пробирки по 2 мл, охлаждали до 45°C и о ставляли при этой темпера -туре на водяной бане. При проведении тест-анализа в пробирки добавляли по 100 мкл ночной культуры бактерий и анализируемый мутаген в подобранной ранее концентр ации (в контроле - растворитель). Если тест-анализ проводили с метаболической активацией, то добавляли еще 0,5 мл активационной среды, содержащей калий-фосфатный буфер (рН 7,4), MgCl2, NADP, глюкозо-6-фосфат и Б9-фракцию из печени индуцированных ароклором 1254 крыс. C месь быстро перемешивали и выливали на подготовленные чашки, равномерно распределяя ее по поверхности нижнего слоя агара. Через 48 ч инкубации при 37°C в верхнем слое агара в виде мелкой сеточки были видны колонии бактерий-ауксотрофов, а на их фоне -проросшие в нижний слой агара отдельные колонии ревертантов по гистидиновому локусу. Частота спонтанных ревертантов составляла 20-50 на чашку. В качестве контр олей использовали клетки бактер ий Salmonella typhumurium ТА98, не подвергшиеся мутагенному воздействию и подвергшиеся действию прямого мутагена
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.