ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 3, с. 323-332
ГЕНЕТИКА ^^^^^^^^^^^^^^
МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 576.851.155:633.31
МУТАНТ Tr63 ПО ГЕНУ tolC ШТАММА СХМ1-188 Sinorhizobium meliloti НЕ СПОСОБЕН К ФОРМИРОВАНИЮ ЭФФЕКТИВНОГО СИМБИОЗА
С ЛЮЦЕРНОЙ
© 2007 г. Т. В. Затовская1, Л. А. Шарыпова2, Е. В. Селиверстова1, Б. В. Симаров1
1 Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, Санкт-Петербург-Пушкин 196608; факс: (812) 470-43-62; e-mail: genet@yandex.ru 2 Department of Genetics, Faculty of Biology, Bielefeld University, Bielefeld, Germany Поступила в редакцию 03.05.2006 г.
tolC мутант Tr63 Sinorhizobium meliloti был получен при помощи неспецифического Тп5-мутагенеза у эффективного штамма СХМ1-188. Мутант не образовывал светящихся ореолов (гало) в УФ-свете на среде с калькофлуором белым, что свидетельствовало об изменении у него продукции ЭПС1. Мутант Tr63 был также бесслизистым на минимальной среде и среде MOPS с низким содержанием фосфора, что могло быть связано с отсутствием у него второго экзополисахарида S. meliloti - ЭПС2. Мутант был дефектным в симбиозе c люцерной и образовывал на корнях растений-хозяев M. sativa и M. truncatula белые круглые Fix -клубеньки или клубеньки неправильной формы, которые по своей структурной организации не отличались от клубеньков, образуемых ЭПС1-мутантами. По данным секвенирования фрагмента ДНК мутанта, смежного с транспозоном, было установлено, что Tr63 содержит Тп5-инсерцию в гене SMc02082, расположенном на хромосоме S. meliloti. Данный ген кодирует протеин, гомологичный протеину TolC, который является компонентом секреторной системы I типа и служит для экспорта белковых токсинов и протеаз у грамотрицательных бактерий. При помощи поликлональных антисывороток анализировали присутствие в культуральной жидкости мутанта Tr63 и родительского штамма белков ExsH (эндогликаназы ЭПС1) и ExpE1 (необходимого для секреции ЭПС2), которые экспортируются через секреторные системы I типа. Было установлено, что у мутанта Tr63 секреторные белки ExsH и ExpE1 в культуральной жидкости отсутствуют. Предполагается, что у S. meliloti протеин TolC вовлечен в секрецию белков ExsH и ExpE1.
Бактерии сем. Rhizobiaceae вступают в симбиоз с бобовыми растениями, при этом на корнях растений формируются клубеньки, в которых бактерии, преобразованные в бактероиды, фиксируют атмосферный азот. Формирование симбиоза -высокоспецифичный процесс, требующий участия различных сигнальных молекул обоих партнеров. Известно, что наряду с липоолигосахаридами (Nod-факторами) бактерий, которые запускают и контролируют самые ранние этапы образования клубеньков у растения-хозяина [1], важную роль в становлении симбиоза играют также различные поверхностные полисахариды. Клубеньковые бактерии обычно образуют четыре типа полисахаридов - экзополисахариды (ЭПС), капсулярные полисахариды (КПС), липополисахариды (ЛПС) и циклические в-1,2-глюканы [2]. В формировании симбиоза Sinorhizobium теШой с люцерной необходимо участие экзополисахаридов. Показано, что мутанты S. теШой, дефектные в синтезе экзополисахарида сукциногликана, образуют на корнях растений неэффективные клубеньки, или псевдоклубеньки [3, 4]. В таких клубеньках отсутствует зона активной азотфиксации, вместо нее большую часть клубенька занимает зона старе-
ния [4]. Предполагается, что ЭПС S. теШой являются сигнальными молекулами, отменяющими защитную реакцию, которая обычно развивается со стороны растения-хозяина в ответ на вторжение бактерий [4].
Экзополисахариды S. теШоН были детально изучены у эталонных штаммов Rm1021 и Rm2011, имеющих общее происхождение. Было показано, что бактерии этих штаммов продуцируют два типа экзополисахаридов - сукциногликан, обозначаемый как ЭПС1, и галактоглюкан, обозначаемый как ЭПС2. Сукциногликан построен из октаса-харидных звеньев, каждое из которых содержит 7 остатков глюкозы и один остаток галактозы, соединенных Р-1,4-, в-1,3- и Р-1,6-связями, и заместители - сукцинат, пируват и ацетат [5, 6]. Субъединица галактоглюкана состоит из одного остатка глюкозы и одного остатка галактозы, соединенных а-1,3- и Р-1,3-связями, и заместителей - пирувата и ацетата [7]. Синтез и экспорт ЭПС1 детерминируются генами кластера exo/exs, расположенного на мегаплазмиде pSymb S. теШо-Н (ранее известной как мегаплазмида 2) [8]. Кластер генов ехр на той же мегаплазимиде контролирует синтез и экскрецию ЭПС2 [9]. В обычных
323
3*
условиях 5. теШой продуцирует ЭПС1. Продукция ЭПС2 наблюдается только при низкой концентрации фосфатов в среде [10, 11], мутациях в регуляторном гене mucR [12] или в гене expR [13], расположенных на хромосоме. Известно, что только низкомолекулярные формы обоих полисахаридов являются активными в процессе становления симбиоза [14, 15]. Для ЭПС1 - это молекулярная фракция размером в три повторяющиеся единицы [16], для ЭПС2 - это фракция размером в 15-20 субъединиц [15]. Высокомолекулярные фракции экзополисахаридов не имеют биологической активности в симбиозе, но играют важную роль в осмопротекции бактерий [17].
У Б. теШоН существуют два различных механизма, обеспечивающих наличие низкомолекулярных фракций экзополисахаридов. Было показано, что мембранные протеины ЕхоР, ExoQ и ЕхоТ вовлечены в процессы полимеризации и секреции сукциногликана таким образом, что осуществляют одновременно синтез и высокомолекулярного ЭПС1, и низкомолекулярных фракций ЭПС1, состоящих из октасахаридных мономеров, димеров и тримеров. При этом ЕхоР может регулировать соотношение низкомолекулярного и высокомолекулярного ЭПС1 [16, 18]. Помимо этого, Б. те-Шой выделяет во внешнюю среду секреторные эндогликаназы, которые обладают специфической активностью по отношению к высокомолекулярному ЭПС1. Известны три эндогликаназы, расщепляющие Р-1,3- и |3-1,4-связи сукциногликана: ЕхоК, ExsH и EglC [19-21]. Эндогликаназы, расщепляющие ЭПС2 у Б. теШой, пока не идентифицированы. Однако было показано, что секреторный протеин ЕхрЕ1 необходим для экспорта высокомолекулярного ЭПС2 [22].
Протеины ExsH и ЕхрЕ1 выделяются во внешнюю среду при помощи секреторной системы I типа [20, 22]. Эту систему составляют три компонента: 1) АВС-транспортер, 2) вспомогательный белок (вместе они образуют специфичный к субстрату и богатый энергией комплекс во внутренней мембране), и 3) белок-канал, обычно из семейства протеинов То1С, который обеспечивает прохождение секреторных белков через периплаз-матическое пространство [23]. Как правило, белки, экспортируемые через секреторные системы I типа, содержат небольшие пептидные последовательности, богатые глицином, так называемые RTX-по-вторы, которые участвуют в связывании Са2+ [23]. Эндогликаназа ЕхоК экспортируется через секреторную систему II типа [19]. Для этого типа секреторных протеинов характерно наличие ^концевых сигнальных пептидных последовательностей.
В данной работе мы описываем мутант штамма СХМ1-188 Б. теШой с Тп5-инсерцией в гене ОС. Мутант формировал на растениях-хозяевах
M. sativa и M. truncatula Fix-клубеньки. Предполагается, что белок TolC у S. meliloti является третьим компонентом секреторной системы I типа и необходим для секреции протеинов ExpEl и ExsH и неидентифицированных еще протеинов, необходимых для формирования симбиоза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериальные штаммы, среды. В работе были использованы следующие штаммы S. meliloti: CXM1-188 [24], Rm1021 [25], Tr63 (данная работа), а также штаммы Rm2011exoY [6], CXM1-188exoY и Tr63exoY, которые были получены путем переноса мутации exoY в штаммы CXMl-188 и Tr63. Бактерии S. meliloti выращивали на средах TY или LB [26]. Антибиотики -стрептомицин и канамицин - добавляли в концентрациях 800 и 200 мг/л соответственно. Среды для тестирования поверхностных полисахаридов бактерий были описаны в [26]. Для определения продукции сукциногликана у штаммов использовали среду LB с 0.02%-ным калькофлуором белым. Среду MOPS с 0.1 мМ K2HPO4 готовили, как описано в [10].
Транспозоновый мутагенез и трансдукцию проводили, как было описано ранее [27]. Для трансдукции использовали фаг фМ12. Анализ ЛПС и КПС проводили при помощи ДСН-ПААГ-электрофореза, как описано в [27]. Симбиотиче-ский фенотип штаммов изучали в условиях стерильного микровегетационного опыта на люцерне M. sativa, сорт Вега, и люцерне M. truncatula, сорт Jamalong, как было описано в [27].
Электронно-микроскопические исследования клубеньков выполняли, как описано в [28].
Методы работы с ДНК. Бактериальную ДНК выделяли по стандартной методике [29]. Клонирование, рестрикцию ДНК, лигирование, трансформацию, выделение плазмидной ДНК проводили согласно стандартным протоколам [25].
Определение нуклеотидной последовательности ДНК. Секвенирование проводили с использованием терминирующих нуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями, на се-квенаторе ДНК MegaBASE1000 ("Amersham Biosciences"). Для определения последовательности ДНК, смежной с Tn5, был использован прай-мер 5'-GAGAACACAGATTTAGCCCAG-3', гомологичный последовательности ДНК инвертированных повторов транспозона Tn5. Сравнение секвенирован-ных последовательностей с последовательностями генетического банка данных (GeneBank) проводили с помощью программы BLAST.
Анализ секреторных белков. Для получения секреторных белков бактерии S. meliloti выращивали 3 сут (OD600 = 1.7) в 800 мл минимальной сре-
ды Винсента [30] при 300 об/мин. Клетки осаждали центрифугированием дважды, супернатант пропускали через фильтр Nalgene, добавляли к фильтрату смесь ингибиторов протеиназ фирмы Sigma и лиофильно сушили. Высушенный фильтрат растворяли в воде. Белки экстрагировали буферно-фенольной смесью: к 25 мл раствора добавляли 0.5 М трис-HCl (pH 6.8) (2 мл), 1 М ДТТ (200 мкл), 90% фенола (6 мл), перемешивали, центрифугировали при 6 тыс. об/мин, отбирали фе-нольную фазу. Добавляли 20 мл этанола, 1 мкл 1 М ДТТ, 30 мкл 8 М ацетата аммония, перемешивали, замораживали и выдерживали при -20°C несколько часов, центрифугировали 10 мин при 6 тыс. об/мин, супернатант удаляли. Осадок промывали в 70%-ном этаноле и подсушивали. Перед нанесением на гель белки растворяли в буфере RB
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.