научная статья по теме МУТАЦИИ, ПОВЫШАЮЩИЕ СЕЛЕКТИВНОСТЬ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЦИТОКИНА TRAIL К РЕЦЕПТОРУ DR5, УСИЛИВАЮТ ЕГО ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ ПО ОТНОШЕНИЮ К ОПУХОЛЕВЫМ КЛЕТКАМ Химия

Текст научной статьи на тему «МУТАЦИИ, ПОВЫШАЮЩИЕ СЕЛЕКТИВНОСТЬ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЦИТОКИНА TRAIL К РЕЦЕПТОРУ DR5, УСИЛИВАЮТ ЕГО ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ ПО ОТНОШЕНИЮ К ОПУХОЛЕВЫМ КЛЕТКАМ»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 8, с. 1298 - 1311

УДК 577.29

МУТАЦИИ, ПОВЫШАЮЩИЕ СЕЛЕКТИВНОСТЬ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЦИТОКИНА TRAIL К РЕЦЕПТОРУ DR5, УСИЛИВАЮТ ЕГО ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ ПО ОТНОШЕНИЮ К ОПУХОЛЕВЫМ КЛЕТКАМ

© 2015 М.Э. Гаспарян1*, М.Л. Бычков1, А.В. Яголович12, Д.А. Долгих1,2, М.П. Кирпичников1,2

1 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва; факс: +7(495)330-6538, электронная почта: marine_gasparian@yahoo.com

2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва

Поступила в редакцию 23.12.14 После доработки 18.02.15

TRAIL (tumour necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand) — цитокин суперсемейства фактора некроза опухолей вызывает апоптоз опухолевых клеток, связываясь с рецепторами смерти DR4 и DR5, не затрагивая нормальные клетки. Однако терапевтическое применение TRAIL ограничено, так как значительная часть опухолевых клеток к нему нечувствительна. Одной из причин этого является взаимодействие цитоки-на с рецепторами «ловушками» DcR1 и DcR2, которые не только не запускают апоптотический сигнал, но и ингибируют сигнал рецепторов смерти. Ранее был получен уникальный DR5 селективный мутантный вариант TRAIL DR5-B, который связывается с DR5 рецептором так же эффективно, как и исходный цитокин, однако практически не связывается с рецепторами DR4 и DcR1, а его сродство к DcR2 снижено в 400 раз. В данной работе проведен сравнительный анализ цитотоксической активности TRAIL дикого типа и DR5-B на 12 различных опухолевых клеточных линиях и двух типах нормальных клеток. В девяти из 12 линий DR5-B убивал в 1,5—5 раз больше опухолевых клеток по сравнению с TRAIL и не проявлял токсичность по отношению к нормальным клеткам. Химиопрепараты, такие как доксорубицин, паклитаксел и бортезомиб, усиливали действие вариантов TRAIL, но на большинстве типов клеток эффект усиления был сильнее выражен для DR5-B. Полумаксимальные эффективные концентрации (ЭК50) для DR5-B при совместном применении с химиопрепаратами были в 1,5—10 раз ниже по сравнению с TRAIL дикого типа. Таким образом, препарат DR5-B можно рассматривать в качестве перспективного средства, как для монотерапии, так и для комбинирования с химиотерапией, при лечении TRAIL устойчивых опухолей.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: TRAIL, DR5-специфичный вариант TRAIL DR5-B, доксорубицин, паклитаксел, бортезомиб, терапия рака.

Белок TRAIL был идентифицирован на основе гомологии последовательности с другими членами суперсемейства фактора некроза опухоли (ФНО) в 1995 г., и тогда же было показано, что многие нормальные ткани экспрессируют TRAIL [1]. В отличие от других членов суперсемейства ФНО, TRAIL обладает уникальной способностью выборочно индуцировать апоптоз в опухолевых клетках in vitro и in vivo, не затрагивая нормальные клетки [2, 3]. Это захватывающее открытие послужило основой для разработки ряда агонистов к рецепторам смерти TRAIL DR4 и DR5, таких как моноклональные антитела, рекомбинантный растворимый внеклеточ-

* Адресат для корреспонденции.

ный домен TRAIL и его рецептор-специфичные варианты [4, 5]. Эти агонисты продемонстрировали значительную противоопухолевую активность в ряде доклинических исследований, однако в клинических испытаниях их терапевтический эффект был весьма ограничен [6, 7].

Чувствительность опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу регулируется на нескольких уровнях: экспрессия TRAIL и его рецепторов, формирование смерть-индуци-рующего сигнального комплекса (DISC, death-inducing signaling complex), активация каспазы 8 и митохондриальный путь апоптоза (регуляция белков семейства Bcl-2, Smac/DIABLO, IAPs) [8]. Одной из причин устойчивости опухолевых клеток к TRAIL является сложное взаимодей-

ствие цитокина с пятью рецепторами, из которых только два DR4 и DR5, получившие название «рецепторы смерти», способны передавать сигнал апоптоза. Два трансмембранных рецептора (DcR1 и DcR2) и один растворимый рецептор остеопротегерин (OPG) получили название «рецепторов ловушек» (DcR — decoy receptors), так как они не только не передают сигнал апоп-тоза, но и могут ингибировать TRAIL-опосредо-ванный апоптоз. Было показано, что DсR1 предотвращает сборку индуцирующего смерть сигнального комплекса, связываясь с DR4 в липид-ных рафтах, тогда как DcR2 включается в состав DISC совместно с DR5, и ингибирует активацию инициаторной каспазы-8 [9].

Многие линии опухолевых клеток экспресси-руют оба рецептора смерти DR4 и DR5, и каждый из этих рецепторов может инициировать апоп-тоз независимо друг от друга. Сродство TRAIL к рецепторам смерти и рецепторам ловушкам практически не отличается (Kd = 0,5—0,9 нМ) [10, 11]. Тем не менее в опухолевых клетках, экспрессирующих рецепторы DR4 и DR5, сигнал от TRAIL часто проводится преимущественно посредством одного из рецепторов смерти. Молекулярная основа такой селективности неизвестна, но эксперименты с использованием моноклональных антител к рецепторам смерти указывают на возможность независимого проведения сигнала от TRAIL через гомотримеры DR4 или DR5 [12, 13]. Результаты исследований последних лет указывают на доминирующую роль DR5 в индукции апоптоза под действием TRAIL.

Многие опухолевые клеточные линии, а также первичные опухоли полностью нечувствительны к агонистам рецепторов DR4 и DR5, несмотря на достаточную экспрессию этих рецепторов. Противоопухолевые средства, такие как доксорубицин, цисплатин, паклитаксел, то-потекан, этопозид, а также ингибиторы протеа-сом и деацетилаз гистонов повышают экспрессию рецепторов смерти и чувствительность клеток к TRAIL [14, 15]. Результаты клинических испытаний рекомбинантного препарата TRAIL дикого типа (лекарственное название Dulanermin), а также препаратов моноклональных антител к DR5 (Lexatumumab, Conatumumab, Drozitumab, Tigatuzumab и LBY-135) и к DR4 (Mapatumumab), как при монотерапии, так и в комбинации с различными химиопрепаратами, не показали желаемого клинического эффекта [5]. Теоретически антитела к рецепторам смерти должны более эффективно убивать опухолевые клетки, так как они не связываются с рецепторами ловушками. Однако антитела имеют несколько недостатков по сравнению с TRAIL. Во-первых, для эффек-

тивного формирования смерть-индуцирующего сигнального комплекса они требуют присутствия сшивающих агентов или Fc-рецепторов (FcyRs) [16], а во-вторых, стоимость производства моноклональных антител намного выше по сравнению с рекомбинантными белками. С другой стороны, довольно сложно создать мутант-ные варианты белка TRAIL, которые бы селективно связывались только с рецепторами смерти, но не с рецепторами ловушками. Были созданы несколько DR4- или DR5-специфичных мутантных вариантов, однако их аффинность к рецепторам ловушкам DcR1, DcR2 и OPG оставалась довольно высокой [11, 17, 18].

Ранее нам удалось создать уникальный му-тантный вариант цитокина TRAIL — DR5-B, который связывается с рецептором смерти DR5 так же эффективно, как и дикий тип, но практически не связывается с другими рецепторами TRAIL (DR4, DcR1, DcR2 и OPG) [11]. В данной работе мы провели сравнительный анализ цитоток-сической активности препаратов TRAIL дикого типа и полученного нами рецептор-селективного варианта цитокина DR5-B на двенадцати опухолевых клеточных линиях и двух типах нормальных клеток. Кроме того, было исследовано комбинированное воздействие вариантов TRAIL c химиопрепаратами, такими как доксорубицин, бортезомиб и паклитаксел. Результаты показали, что DR5-B эффективнее индуцирует гибель опухолевых клеток по сравнению с диким типом TRAIL в большинстве линиях клеток. Химиотерапевтические препараты усиливали действие обоих препаратов, при этом полумаксимальные эффективные концентрации DR5-B были существенно ниже, чем у дикого типа TRAIL. Таким образом, препарат DR5-B можно рассматривать в качестве перспективного средства, как для монотерапии, так и для комбинирования с химиотерапией, при лечении опухолевых заболеваний.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клеточные линии и реактивы. Опухолевые клеточные линии человека аденокарциномы легкого А549, Т-лимфобластной лейкемии Jurkat, ге-патоклеточной карциномы HepG2, колорек-тальной карциномы НТ29, аденокарциномы молочной железы MCF-7, моноцитарной лейкемии и937, глиобластомы и251 MG и нормальные фибробласты крайней плоти (HFF) были приобретены в НИИ цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Клеточные линии колоректальной карциномы НСТ116, карциномы простаты Би145, аденокарциномы молоч-

ной железы SKBR-3 и MDA-MB-231, а также аденокарциному яичника SKOV3 приобретали в АТСС (Вашингтон, США). Клетки эндотелия пупочной вены человека (HUVEC) были любезно предоставлены доктором М.А. Лагарьковой (НИИ Общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН). Питательные среды для эукариотических клеток (DMEM, EMEM и RPMI1640), 0,05%-ный раствор трипсин-ЭДТА, заменимые аминокислоты, таблетки фосфатно-солевого буфера и МТТ приобретались в компании «ПанЭко» (Россия). Эмбриональную бычью сыворотку приобретали у «Hyclone» (США). Конъюгированные с FITC антитела к рецепторам DR4, DR5, DcR1 и DcR2 покупали у «Abnova» (США), антитела изотипи-ческого контролья были от фирмы «Immunotech» (Франция). Бортезомиб и доксорубицин приобретали у фирмы «Santa Cruz» (США), паклитаксел — «MP Biomedicals» (Германия). Все прочие реактивы покупали в фирме «Applichem» (Германия).

Экспрессия и очистка рекомбинантных препаратов TRAIL и DR5-B. Рекомбинантные препараты внеклеточного домена TRAIL дикого типа (114—280 а.о.) и его DR5-специфичного варианта DR5-B получали из Escherichia coli как было описано ранее [11]. Гибридные белки тиоредок-син-TRAIL и тиоредоксин-DR5-B были экспрес-сированы в штамме E. coli BL21(DE3), трансформированном плазмидной ДНК pET-32а/TRAIL или pET-32а/DR5-B. Очистку гибридных белков проводили c помощью металл-аффинной хроматографии на колонке с сорбентом Ni-Sepha-rose High Performance («GE Healthcare», США). Очищенный гибридный белок расщепляли ре-комбинантной легкой цепью энтеропептидазы человека, полученной нами ранее [19]. Для увеличения эффективности расщепления слитных белков и уме

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком