ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 6, с. 859-864
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.224:579.852.11
МУТАЦИИ, ПРИВОДЯЩИЕ К ИЗМЕНЕНИЮ СПЕЦИФИЧНОСТИ СЕНСОРНОЙ РНК, КОДИРУЕМОЙ ГЕНОМ pbuE Bacillus subtilis
© 2007 г. К. В. Лобанов, Н. В. Королькова, С. Ю. Еремина, Л. Эррайс Лопес,
С. А. Прошкин, А. С. Миронов
Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва 117545; факс: (495) 315-05-01; e-mail: alexmir@genetika.ru Поступила в редакцию 09.10.2006 г.
Проведен сайт-направленный мутагенез лидерной области гена pbuE Bacillus subtilis, которая кодирует аденин-специфическую сенсорную РНК. Показано, что присутствие в консервативной области лидера (A-бокс) двух нуклеотидных замен 70U —С и A100 —»- G приводит к изменению специфичности сенсорной РНК in vivo: вместо аденина позитивным эффектором транскрипции становится гуанин.
Ген pbuE Bacillus subtilis кодирует синтез трансмембранного белка, ответственного за транспорт из клетки пуриновых оснований, и локализуется на 53.50° хромосомной карты. Первоначально было показано, что экспрессия гена pbuE возрастает при добавлении в среду пуриновых оснований, в частности гуанина, однако механизм этой регуляции оставался неясным [1]. Несколько лет назад был обнаружен новый тип ре-гуляторных лидерных РНК, которые выступают в качестве сенсоров специфических метаболитов -малых молекул (витамины В1 и В2) и напрямую без белковых посредников регулируют транскрипцию [2] или трансляцию [3] соответствующих мРНК. Такие сенсорные РНК представляют собой природные аптамеры и получили наименование "рибо-переключателей" ("riboswitch"), так как способны формировать альтернативные вторичные структуры в зависимости от присутствия специфического метаболита и модулировать процесс элонгации транскрипции мРНК или инициации трансляции этих мРНК [4-6]. В дальнейших работах выяснилось, что лидерные области ряда генов пуринового метаболизма у B. subtilis содер-
жат консервативную последовательность ^-бокс), которая способна выступать в качестве сенсора пуриновых оснований, и расположенный за ней классический Rho-независимый терминатор транскрипции [7]. На модели гена хр1 было показано, что вторичная структура лидерной мРНК подвержена конформационным изменениям: в присутствии эффекторов - гуанина или гипо-ксантина (Н) происходит формирование терминатора транскрипции, а в их отсутствие - антитерминатора, обеспечивающего сквозную транскрипцию структурной части гена [7]. Очень похожая на G-бокс нуклеотидная последовательность была обнаружена и в лидерной области гена рЬиЕ [8]. Сравнение нуклеотидной последовательности лидерной мРНК генов хр1 и рЬиЕ (рис. 1) обнаруживает большую гомологию, особенно в участках, расположенных между шпильками, и выявляет возможность формирования трех потенциальных шпилечных структур (Р1/Р1', Р2/Р2' и Р3/Р3') (рис. 2).
Более того, выяснилось, что лидерная мРНК гена рЬиЕ также выполняет сенсорную функцию, но в отличие от G-бокса гена xpt эффектором
xpt
P1
+ 1 +20 5' - AAAUAUAAUAGGAACACUCAUAUAA C
P2 P2'
+ 40 GAUAUGG
AGUUUCUA'
P3
P3' P1'
+ 60
CGUAAAg
ACUAUGGGUGAGCAAU
pbuE
+ 1 +20 5' - AGCUAUUAUCACUUGUAUAA
И GG
11 GU
+ 80
^AUUACAAAAUUUGUUU C
Рис. 1. Сравнение нуклеотидной последовательности лидерных областей мРНК генов xpt и рЬиЕ В. subtilis. Выделены три потенциальные шпилечные структуры (Р1/Р1', Р2/Р2' и Р3/Р3'). Гомологичные основания подчеркнуты. Жирным шрифтом выделены основания, в которых были получены мутации, а соответствующие нуклеотидные замены указаны стрелками. Нумерация нуклеотидов приведена, начиная со стартов транскрипции генов xpt и рЬиЕ.
ggu u u
u uugagg
a i i i i i_i
u aacucc
a a u p2 a
p2 20 a
g u c u u a
40 g _ c p3 a c c
CAgga g
..........u
guccu a
a . a aa ^60
u
A
u a u ua P1 G- c ua
a
uu u • g ua gc
100
u - a 80-u - a
5' ppp agcuauuaucac aa u u uuuuuug uaaucagga uuuuuuuu -
a
j g 4° g u
u uuugagg a
g uc
g
u
u
aa
uaacucc
P2
a
20 a
cca
ua u
P1 g u u
' ppp agcuauuaucac
c
P3
a a c c
uau
u • g u - a 80 g c uu au ua u u au au au c-g
a-u 100 u-a/ u-a—g
au gc
u aggauuuuuuuu c c u a a ga ua
60
Рис. 2. Модель вторичной структуры А-бокса генарЬиЕВ. subtШs. а - конфигурация А-бокса в присутствии эффектора - аденина. Терминирующая шпилька разрушена, происходит сквозная транскрипция структурного гена рЬиЕ; б -формирование терминирующей шпильки в А-боксе в отсутствие аденина. Транскрипция структурного гена рЬиЕ заблокирована. Рамками выделены основания, в которых были получены мутации.
этой мРНК служит не G или Н, а аденин (А), поэтому аптамерный участок лидерной мРНК гена рЬиЕ получил наименование А-бокса [8]. Другая интересная особенность А-бокса состоит в том, что в присутствии А наблюдается не репрессия, а активация транскрипции гена рЬиЕ. Таким образом, если в случае гена хр1 добавление экзогенных G и Н стабилизирует терминирующую шпильку, то в случае гена рЬиЕ присутствие А приводит к такому изменению конформации лидерной области, при котором структура терминатора транскрипции разрушается и обеспечивается сквозная транскрипция структурной части гена. Любопытно, что в областях лидерной мРНК, расположенных между шпильками, нуклеотид-ные последовательности гуанин-регулируемой хр1 мРНК и аденин-регулируемой рЬиЕ мРНК обнаруживаются всего три различия. Примечательно, что одна из замен расположена между шпильками Р3/Р3' и Р1/Р1': это основание 75С в гуанин-регулируемой хр1 мРНК ^-бокс) и основание 70и в аденин-регулируемой рЬиЕ мРНК (А-бокс) -
рис. 1. Было высказано предположение, что именно это различие определяет специфичность связывания соответствующих аптамеров с метаболитами-эффекторами, так как G и H могут спариваться с основанием 75С в G-боксе, тогда как А - с основанием 70U в A-боксе в результате классического Уотсон-Криковского взаимодействия [7]. Это предположение подтверждается данными in vitro, согласно которым константа связывания аденина с мутантным A-боксом резко снижается, а гуанина, напротив, повышается [8], а также результатами недавно опубликованного рентгеноструктурного анализа трехмерной структуры А-бокса гена pbuE B. subtilis [9]. Однако на фенотипическом уровне изменение специфичности А-бокса не проявлялось: введение нуклеотид-ной замены 70U —► С в A-бокс приводило к конститутивной, не регулируемой пуринами экспрессии гена pbuE [8]. Таким образом, механизм функционирования А-бокса in vivo, в частности вопрос о корреляции между его сенсорными свойствами и способностью модулировать экспрес-
сию гена pbuE - требует дальнейших исследований.
Настоящая работа посвящена мутационному анализу лидерной области гена pbuE B. subtilis и предпринята с целью выяснения роли отдельных нуклеотидов в определении специфичности сенсорной мРНК гена pbuE в отношении связывания эффекторов - пуриновых оснований, а также изучения влияния полученных мутаций на экспрессию гена pbuE.
В работе использовался штамм B. subtilis Mu8u5u6 (leu, met, purF) из коллекции ВКПМ ГосНИИгенетика. Для выращивания бактерий использовали стандартную среду Спицайзена с необходимыми добавками [10]. Манипуляции с ДНК (выделение плазмидной ДНК, клонирование, трансформацию и анализ рекомбинантных плазмид) проводили с использованием стандартных методов, изложенных в [11]. Препараты ферментов - эндонуклеазы рестрикции, Т4 ДНК-ли-газа, термостабильная Гад-полимераза получены от фирмы "MBI Fermentas"; AMV-ревертаза - от фирмы "GE Healthcare".
Для клонирования лидерной области гена pbuE, включающей промотор, с помощью ПЦР амплифицировали соответствующую область хромосомы B. subtilis, используя фланкирующие праймеры Y1 (5'-ttcaactgctatcccccctg) и Y2 (5'-ccaatccgactgcaatcgtag). Полученный фрагмент клонировали с использованием эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BamHI в полилинкерную последовательность экспрессионного интегративного вектора pDG268, как описано в работе [2]. Вектор pDG268 содержит экспрессионную кассету, которая включает полилинкер для клонирования промоторов, реперный ген lacZ без собственного промотора и ген устойчивости к хлорамфениколу (CmR). Кассета фланкирована фрагментами гена amyE, что позволяет проводить интеграцию вектора с клонированным фрагментом в локус amyE на хромосоме B. subtilis. Клонирование промотор-ных участков в вектор pDG268 приводит к образованию транскрипционных фьюзов промотора с геном lacZ в составе хромосомы.
Мутации в лидерной области гена pbuE получали методом сайт-направленного мутагенеза с помощью ПЦР, используя специфические праймеры: Y3 (5'-cacttgtataaGGtcaataatatgg) - замены 21С —- G, 22С —- G; Y4 (5'-gggtctacGTggaaccg-taaaat) - замены 50C —- G, 51A —► U; Y5 (5'-gtaaaatcctgaCtacaaaatttgtt) - замена 70U —- С; Y6 (5'-gacattttttgtaGtcaggatttttttta) - замена 100A —► G. ПЦР проводили на приборе Gene Amp PCR System 2400 (фирма "Perkin-Elmer Cetus"). Температурный режим подбирали с учетом длины амплифи-цированного фрагмента, длины и состава используемых праймеров. Выделение и очистку ПЦР-продуктов проводили с использованием набора
C T A G
,C
A
A
T
T
A
A
A
T
A*
G
C
T
A
T
T
A
T
C
A
C
Рис. 3. Определение сайта инициации транскрипции методом "достройки праймера" с использованием 32Р-меченного праймера Y7. Стрелкой указан основной транскрипт, образующийся в реакции удлинения праймера.
GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (фирма "GE Healthcare").
Присутствие соответствующих мутаций проверяли секвенированием по методу Сэнгера [12].
Для выделения суммарной РНК клетки штамма Mu8u5u6 подращивали в 10 мл LB-среды до логарифмической фазы роста в присутствии А (1 мМ). Выделение суммарной РНК проводили методом гуанидинтиоцианатной экстракции [11].
Определение старта транскрипции проводили с использованием AMV-ревертазы, 32Р-меченно-го праймера Y7 (5'-aaatcctgattacaaaaaatgtc) и 7080 мкг суммарной РНК согласно [11].
Активность ß-галактозидазы определяли методом Миллера [13]. Бактериальную культуру выращивали при 37°С в жидкой среде Спицайзена с необходимыми добавками и глюкозой (0.4%) в качестве единственного источника углерода до экспоненциальной
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.