научная статья по теме МУТАЦИИ СТРУКТУРНЫХ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА ТРИПТОФАНА ПО КИНУРЕНИНОВОМУ ПУТИ В МОДУЛЯЦИИ ЗВЕНЬЕВ СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА – РЕЦЕПТОРЫ ГЛУТАМАТА-АКТИН ЦИТОСКЕЛЕТА Биология

Текст научной статьи на тему «МУТАЦИИ СТРУКТУРНЫХ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА ТРИПТОФАНА ПО КИНУРЕНИНОВОМУ ПУТИ В МОДУЛЯЦИИ ЗВЕНЬЕВ СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА – РЕЦЕПТОРЫ ГЛУТАМАТА-АКТИН ЦИТОСКЕЛЕТА»

ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 10, с. 1396-1401

^=ОБЩАЯ

ГЕНЕТИКА

УДК 575.17:59151

"Как проследить путь от гена к поведению - вот проблема, которая не так-то скоро перестанет быть актуальной..."

(Сеймур Бензер, 1975)

МУТАЦИИ СТРУКТУРНЫХ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА ТРИПТОФАНА ПО КИНУРЕНИНОВОМУ ПУТИ В МОДУЛЯЦИИ ЗВЕНЬЕВ СИГНАЛЬНОГО КАСКАДА -РЕЦЕПТОРЫ ГЛУТАМАТА-АКТИН ЦИТОСКЕЛЕТА

© 2007 г. Н. Г. Лопатина, Т. Г. Зачепило, Е. Г. Чеснокова, Е. В. Савватеева-Попова

Институт физиологии им. И.П. Павлова Российской академии наук, Санкт-Петербург 199034; факс: (812) 328-05-01; e-mail: lopatina@kolt.infran.ru Поступила в редакцию 07.05.2007 г.

Используя методы иммуногистохимии и флуоресцентного окрашивания, оценивали характер локализации и уровень содержания белков - компонентов сигнального каскада, соединяющих рецептор-ное звено (рецептор L-глутамата NMDA-подтипа) с актином цитоскелета в головном ганглии у линий дрозофилы Canton-S (дикий тип, контроль) и несущих мутации vermilion, cinnabar, cardinal, последовательно инактивирующих ферменты гидролиза триптофана по пути его метаболизма в оммохромы. Проведенные исследования позволили сделать вывод о модулирующем влиянии генов, контролирующих кинурениновый путь обмена триптофана, на основные звенья сигнального каскада - начальное (NMDA-рецептор, postsynaptic density protein-95 - опорный белок, участвующий в локализации и интернализации рецептора), среднее (лимкиназа-1 - ключевой в ремоделировании актина нейрональный фермент) и конечное (f-актин, играющий критическую роль в морфогенезе си-наптических структур и, как следствие, в процессах синаптической пластичности, обучения и памяти). Высказано предположение о биохимических посредниках действия указанных генов - ки-нуреновой кислоте - эндогенном неспецифическом антагонисте рецепторов L-глутамата и 3-гид-роксикинуренине, оказывающем неспецифический стимулирующий эффект.

Продолжая линию исследований, намеченную И.П. Павловым и его последователями, М.Е. Ло-башевым и его ученицей В.В. Пономаренко, были предложены новые теоретические подходы, положившие начало новому направлению в исследованиях генетики поведения - сравнительной генетики поведения, основанные на представлениях: 1) о гомологии генов, контролирующих основные метаболические пути, определяющие фундаментальные свойства нервной системы у животных разных филогенетических уровней, и 2) об адаптивной (системной, нейрогормональ-ной) регуляции реализации информации, закодированной в этих генах, по принципу обратной связи адекватно влияниям среды и индивидуального опыта. Оба подхода были использованы и интенсивно разрабатывались в исследованиях по ней-рогенетике и генетике поведения, проводимых учениками М.Е. Лобашева и В.В. Пономаренко в Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН [2-5]. Мы исследовали поведенческие и нейроло-гические эффекты мутаций гомологичных генов, контролирующих обмен триптофана у насеко-

мых - того класса животных, для которого оказалась наиболее разработанной биохимическая генетика кинурениновой ветви метаболизма триптофана (рис. 1) и в то же время полностью отсутствовали сведения о роли кинурениновых метаболитов в деятельности нервной системы [6, 7]. Исследования выявили мощный плейотропный эффект мутаций, блокирующих разные этапы кинуре-нинового пути обмена триптофана (КПОТ), на функциональную активность нервной системы и поведение, включая обучение и память (см. обзоры [4, 5, 8]).

На основании полученных фактов оказалось возможным сделать важные выводы: 1) мутации, нарушающие одинаковые звенья обмена триптофана у медоносной пчелы и дрозофилы, приводят к сходным отклонениям в функции нервной системы и поведения; 2) одним из возможных биохимических каналов, опосредующих влияние генов, контролирующих активность ферментов КПОТ, на деятельность нервной системы и поведения, является кинуреновая кислота - эндоген-

ный лиганд рецепторов нейромедиатора L-глута-мата.

Анализ полученных данных позволил высказать гипотезу о возможной причастности действия генов, контролирующих синтез кинурени-нов, к модуляции узловых моментов сигнального пути, связывающего функционирование мембранных глутаматных NMDA (N-metyl-D-aspartat) рецепторов с ремоделированием актина цитоске-лета [9—11]. Гипотеза базировалась на следующих фактах: 1) избирательном увеличении чувствительности рецепторов глутамата (NMDA- и каи-нат-подтипов, I—II группы метаботропных рецепторов) к агонистам у мутантов snow laranja (дефицит кинуренинов) [5, 12, 13]; 2) изменении резистентности к парам эфира у мутантов по гомологичным генам КПОТ дрозофилы и пчелы [14]; 3) литературных данных, свидетельствующих об участии рецепторов глутамата, и в частности NMDA-рецепторов, эндогенным лигандом которых является кинуреновая кислота, в регуляции динамики актина, опосредуемой нейрональным ферментом LIMK-1 у млекопитающих [15]. В связи с этим в задачу настоящего исследования входило определение характера локализации и уровня экспрессии у мутантов КПОТ дрозофилы субъединиц NR1 и NR2 NMDA-рецептора, scaffolding postsynaptic density protein (PSD-95), ключевого в ремоделировании актина цитоскелета ней-ронального фермента LIMK-1, а также состояния фосфорилированной формы деполимеризующе-го актин фактора кофилина (p-cofilin) и фибриллярного актина (f-актина).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования проведены на Drosophila melano-gaster. У этого насекомого известны природные мутации структурных генов ферментов, обеспечивающих гидролиз триптофана по кинуренино-вому пути. Работа проводилась на мухах дикого типа (Canton S, CS, контроль) и трех мутантных линиях: vermilion (v), cinnabar (cn), cardinal (cd). Мутантные линии были приведены к единому генетическому фону. Мутация v нарушает синтез фермента триптофандиоксигеназы, что приводит к отсутствию кинуренинов. Мутация cn нарушает синтез фермента кинуренин-3-гидроксилазы, что приводит к накоплению в мозге нейропротективно-го метаболита - кинуреновой кислоты (KYNA). Мутация cd нарушает синтез фермента фенокса-зинонсинтетазы. Последнее приводит к накоплению в мозге 3-ГОК, который вызывает оксида-тивный стресс и нейродегенерацию. Мух содержали на стандартной изюмно-дрожжевой среде при 25°С и свето-темновом цикле 12 : 12 ч. В опыте были использованы 5-суточные имаго. Для анализа брали от 10 до 30 мух каждого генотипа в

триптамин | | серотонин

| триптофан |

vermilion-

триптофандиоксигеназа

| формилкинуренин|

кинуреновая кислота

кинуренинформамидаза

|кинуренин|

cinnabar

антраниловая кислота

_кинуренингидроксилаза

ксантуреновая гтг--,

кислота | 3-гидроксикинуренин |

cardinal -

^феноксазинонсинтетаза

| оммохромы |

Рис. 1. Мутации кинуренинового пути обмена триптофана у дрозофилы.

отдельном опыте (процедура окрашивания на определенный белок).

Были использованы методы иммуногистохи-мического DAB-окрашивания (для белков NR1, NR2, PSD-95, LIMK-1 и p-cofilin) и флуоресцентного окрашивания на f-актин фаллоидин-радоми-ном срезов головного ганглия дрозофилы.

Получение препаратов мозга дрозофилы. Насекомых подвергали наркотизации холодом. Помещали в специальные заливочные воротнички, разработанные М. Хайзенбергом (Институт биологических наук им. Т. Бовери, Вюрцбург, Германия). Фиксация при 4°С в течение 4 ч (4%-ный формалин на буфере PBS). Отмывка фиксатора - 1 ч в PBS. Обезвоживание: 40%-ный спирт - 30 мин, 70%-ный спирт - 30 мин, 96%-ный спирт - 30 мин, абсолютный спирт - 2 смены по 15 мин. Далее размягчение кутикулы - метилбензоат в течение ночи. Парафинизация при 65°С: метилбензоат с парафином (50 : 50) - 1 ч; 5%-ный раствор воска в парафине - 3 ч. Из блоков готовили срезы толщиной 7 мкм. Использовали желатинизированные стекла.

Иммуногистохимия. Депарафинизация срезов: ксилол - 2 смены по 15 мин. Абсолютный спирт - 10 мин, 96%-ный спирт - 10 мин, 70%-ный спирт - 5 мин, 40%-ный спирт - 5 мин. Деионизо-ванная вода - 2 смены по 5 мин. Демаскировка антигенов: при 95°С в цитратном буфере 3 смены по 5 мин. Охлаждение препаратов 20 мин в PBS. Отмывка в деионизованной воде - 3 смены по 2 мин. Подавление эндогенной пероксидазной активности: 30 мин в 0.3%-ном растворе H2O2. Промывка срезов: 3 смены по 5 мин в 0.1%-ном растворе PBT (PBS + 0.2% Triton). Блокировка антигенов нор-

Компоненты сигнального каскада в головном ганглии различных линий дрозофилы

Линии дрозофилы Содержание метаболитов КПОТ Характер окрашивания срезов мозга (гистохимия)

NR1 NR2 PSD-95 LIMK-1 p-cofilin f-actin

Canton-S vermilion cinnabar cardinal Норма Отсутствуют Избыток KYNA Избыток 3-ГОК Гомогенн Норма + (в ЦК) - (в ЦК) ое окрашива! Норма - (в ЦК) + (в ЦК) ше всего ней - (в ЦК) - (в ЦК) Норма эопиля с мак - (в ЦК) ++ (в ЦК) + (в ЦК) симумом окр Норма Норма Норма аски в ЦК ++ Норма ++

Примечание. ЦК - центральный комплекс, "+" - выше нормы, "-" - ниже нормы.

мальной сывороткой (Normal blocking serum, набор Vectastain ABC-elite KIT, "Vector") - 2 ч. Инкубация с первичным антителом (к NR1 NR2, PSD-95, LIMK-1, p-cofilin, "SantaCrus", разведение 1 : 200) в течение ночи при 4°С во влажной камере. Промывка раствором PBT - 2 смены по 5 мин. Инкубация с биотинилированным антителом (Vectastain ABC-elite KIT) - 1 ч при 37°С. Промывка раствором PBT - 2 смены по 5 мин. Инкубация с ABC-комплексом - 1 ч при 37°С. Промывка PBS 10 мин. Инкубация слайдов с красителем 4 мин при комнатной температуре в темноте. Краситель - диаминобензидин (Vectorperoxidase substrate kit DAB). Промывка - 5 мин в воде. Дегидратация срезов: 40%-ный спирт - 5 мин, 70%-ный спирт - 5 мин, 96%-ный спирт - 5 мин, ксилол -5 мин. Заключение срезов в безводную среду (Entellan). Полученные постоянные препараты анализировали с помощью световой микроскопии при увеличении х10 и установки, содержащей CCD-камеру и компьютер с программой Видео-Тест-FISH.

Флуоресцентное окрашивание naf-актин. Депа-рафинизация срезов: ксилол - 2 смены по 15 мин. Абсолютный спирт - 10 мин, 96%-ный спирт -10 мин, 70%-ный спирт - 5 мин, 40%-ный спирт -5 мин. Деионизованная вода - 2 смены по 5 мин. Инкубация с фаллоидин-родамином ("Molecular Probes", разведение 1 : 3

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»