научная статья по теме МУТАЦИИ В ГЕНЕ SOD1 ПРИ БОКОВОМ АМИОТРОФИЧЕСКОМ СКЛЕРОЗЕ: ВОЗМОЖНОСТИ МЕТОДА МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ Биология

Текст научной статьи на тему «МУТАЦИИ В ГЕНЕ SOD1 ПРИ БОКОВОМ АМИОТРОФИЧЕСКОМ СКЛЕРОЗЕ: ВОЗМОЖНОСТИ МЕТОДА МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, том 47, № 5, с. 861-867

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ^^^^^^

АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ И ИХ КОМПЛЕКСОВ

УДК 57.088.1

МУТАЦИИ В ГЕНЕ SOD1 ПРИ БОКОВОМ АМИОТРОФИЧЕСКОМ СКЛЕРОЗЕ: ВОЗМОЖНОСТИ МЕТОДА МОЛЕКУЛЯРНОГО

МОДЕЛИРОВАНИЯ

© 2013 г. Е. В. Лысогорская*, А. В. Россохин, Н. Ю. Абрамычева, М. Н. Захарова, С. Н. Иллариошкин

Научный центр неврологии Российской академии медицинских наук, Москва 125367

Поступила в редакцию 16.04.2013 г.

Принята к печати 26.04.2013 г.

Перспективным методом оценки структуры белка, позволяющим на уровне атомов представить его энергетически выгодную конформацию, является метод молекулярного моделирования. Этот метод имеет большое значение при исследовании межмолекулярных взаимодействий и подтверждении патогенетической значимости изменений структуры белка, привносимых конкретными мутациями. Мы применили молекулярное моделирование для оценки мутаций в гене SOD1 у пациентов с боковым амиотрофическим склерозом — тяжелым нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся гибелью двигательных нейронов спинного и головного мозга. Продукт гена SOD1 — цитозольный димерный фермент Си^п-супероксиддисмутаза (СОД1), отвечающий в клетке за детоксикацию супероксидных радикалов. Показано, что все 8 выявленных нами кодирующих точечных мутаций гена приводили к умеренному или значительному изменению энергии белка СОД1. Мутация Шэ49А^ повышала энергию белка, а построение соответствующей модели указывало на пространственную дестабилизацию молекулы и нарушение взаимодействия с ионом металла в активном центре. Остальные 7 мутаций ^1у17А1а, Leu85\al, Ап878ег, Ар91А1а, Seг106Leu, Glu134Gly, Ьеи145РИе), напротив, приводили к снижению энергии белка и повышению пространственной стабильности СОД1, что может сопровождаться повышенной склонностью «инертной» мутантной молекулы к мисфол-дингу и внутриклеточной агрегации. Таким образом, результаты анализа т sШco мутаций гена SOD1 подтверждают принадлежность бокового амиотрофического склероза к классу так называемых конформационных болезней центральной нервной системы, характерной чертой которых является формирование в нейронах цитотоксичных нерастворимых белковых включений.

Ключевые слова: боковой амиотрофический склероз, ген SOD1, мутационный анализ, молекулярное моделирование.

SOD1 GENE MUTATIONS IN PATIENTS WITH AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS: POTENTIAL FOR THE METHOD OF MOLECULAR MODELING, by E. V. Lysogorskaia*, A. V. Rossokhin, N. Iu. Abramycheva, M. N. Zakharova, S. N. Illarioshkin (Research Center of Neurology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 125367 Russia; *e-mail: kutakovaev@gmail.com). The molecular modeling method is promising for the assessment of protein structure, being able to present an energetically beneficial protein conformation with atomic precision. This method is of great importance for studying molecular interactions and confirming pathogenic significance of the changes in the protein structure caused by particular mutations. In the present study we used molecular modeling for the assessment of mutations in the SOD1 gene in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS), a severe neurodegenerative disorder characterized by the loss of the spinal and cerebral motor neurons. The product of SOD1 is a cytosolic dimeric enzyme Cu/Zn superoxide dismutase (SOD1) responsible for detoxification of the cellular superoxide radicals. We showed that all 8 revealed coding point mutations of the gene led to moderate or significant changes of the SOD1 protein energy. Mutation His49Arg increased the protein energy, and reconstruction of the respective model pointed out to spatial destabilization of the molecule and abnormal interaction with the metal ion inside the active center. The other 7 mutations (Gly17Ala, Leu85Val, Asn87Ser, Asp91Ala, Ser106Leu, Glu134Gly, and Leu145Phe), on the contrary, led to decrease of the protein energy and increase of the spatial stability of SOD1, which is usually accompanied by increased propensity of the 'inert' mutant molecule to misfolding and cellular aggregation. Thereby, the results of in silico analysis of the SOD1 gene mutations confirm staying of ALS within the class of

Принятые сокращения: БАС — боковой амиотрофический склероз; СОД1 — цитозольная Cu/Zn-супероксидцисмутаза.

*Эл. почта: kutakovaev@gmail.com

the so-called conformational diseases of the central nervous system, a characteristic feature of which is forming of cytotoxic insoluble protein inclusions in neurons.

Keywords: amyotrophic lateral sclerosis, SOD1 gene, mutation analysis, molecular modeling. DOI: 10.7868/S0026898413050121

В последние годы, в связи с развитием компьютерной техники, в биологии стал активно развиваться весьма перспективный подход к изучению молекулярных процессов, определяемый термином "in silico" и связанный с применением методов молекулярного моделирования [1—3]. Данная методика позволяет с разрешением на уровне атомов построить модель анализируемого белка и найти его энергетически оптимальную конформацию [4]. Это имеет большое значение для изучения разнообразных межбелковых взаимодействий, включая рецепторно-лигандные процессы, для анализа молекулярных механизмов развития заболеваний человека и подтверждения патогенетической значимости выявляемых мутаций. Таким образом, молекулярное моделирование позволяет серьезно расширить арсенал традиционных технологий, применяемых в биомедицинских исследованиях.

Использование указанного подхода актуально при исследовании патогенеза нейродегенератив-ных заболеваний, точные механизмы которых до настоящего времени не определены. Одно из таких нейродегенеративных заболеваний — боковой амиотрофический склероз (БАС) — быстро прогрессирующая смертельная болезнь, обусловленная неуклонной гибелью двигательных нейронов, развитием параличей и дыхательной недостаточности [5]. Свыше 90% всех случаев БАС имеют неустановленную этиологию и являются спорадическими, а у остальных пациентов имеют место семейные (как правило, аутосомно-доми-нантные) формы БАС, связанные с редкими мутациями генов SOD1, ALS2, FUS, TARDBP и др. [6-10].

Благодаря идентификации генетических повреждений, ассоциированных с развитием ряда наследственно-семейных и спорадических форм БАС, к настоящему времени известны важные элементы патогенетического каскада при данном заболевании. Так, одним из ключевых белков, чья роль в избирательном повреждении двигательных нейронов при БАС считается твердо установленной, является цитозольная Cu/Zn-супероксид-дисмутаза (СОД1), кодируемая геном SOD1 [11]. СОД1 имеет молекулярную массу 32.5 кДа и отвечает за детоксикацию супероксидных радикалов с превращением их в молекулы кислорода и перекись водорода [11]. СОД1 — чрезвычайно высококонсервативный белок [11, 12], поэтому большинство аминокислотных замен в его составе

должны быть патогенетически значимыми. Однако характер белковой дисфункции при конкретных точечных мутациях SOD1 в большинстве случаев остается неясным. С учетом данных о сохранной активности мутантного фермента можно предположить, что измененный белок приобретает качественно новые цитотоксические свойства [13]. Согласно современным представлениям, цитотоксическая функция мутантного белка СОД1 может реализовываться двумя основными путями: а) через формирование патологических конформеров СОД1 и клеточных белковых агрегатов; б) через нарушение субстратной специфичности мутантного белка и прямое цитотоксическое действие агрессивных метаболитов — продуктов аномального СОД 1-опосредованного катализа [14]. Наиболее вероятно, что в патогенезе БАС имеет значение сочетание обоих вышеуказанных механизмов.

К настоящему времени у пациентов с БАС описано более 160 мутаций в гене SOD1. В данном исследовании представлен выявленный нами спектр мутаций в гене SOD1 в обширной когорте российских пациентов с БАС. Цель работы — установление возможностей метода молекулярного моделирования в качестве дополнительного аналитического подхода, позволяющего подтвердить патогенетическую значимость выявленных мутаций SOD1, и уточнение молекулярных механизмов нейрональной цитотоксичности при данном заболевании.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Молекулярно-генетическое исследование. Образцы геномной ДНК 206 пациентов (98 женщин и 108 мужчин), страдающих БАС, выделяли из крови с помощью набора Wizard® Genomic DNA Purification Kit. Полное секвенирование кодирующей области гена SOD1 проводили на генетическом анализаторе 3130 Applied Biosystems с использованием BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems).

Молекулярное моделирование. Аминокислотные последовательности белков СОД1 (sod_m и sod_h) мыши и человека получены с помощью базы данных SwissProt [15]. В банке белковых структур (Brookhaven Protein Data Bank) получены координаты структур sod_m и sod_h (3GTT и 3ECU соответственно).

МУТАЦИИ В ГЕНЕ SOD1 ПРИ БОКОВОМ АМИОТРОФИЧЕСКОМ СКЛЕРОЗЕ

863

h ' . .. G . Н . 61

к к'ккк'к'кк'к^к'кк'к'ккг к *к к к тк к кг к

■к к к *к к к *к к к Ж к к к *к к к Ж

Ь .... Ъ N. Б ...... Б . .121

т г^?,:: ■■ л ■ г'.гч у^д^х Д^УД\¥ ы Е ояу :: :: ГМУ У - 121

****** * ***** ************** ***** ***** ****** * ***** ***

Ь Е. Ь . 154

* * ******************************

Рис. 2. Схема выравнивания последовательности белка СОД1 мыши (т) и человека (Ь). Жирным шрифтом выделены мутировавшие аминокислотные остатки. Звездочками показаны совпадающие остатки.

СОД1 имеет глобулярную структуру и состоит из двух субъединиц, в активных центрах которых связаны ионы Zn2+ и Cu2+ (рис. 1). При процедуре выравнивания (сравнения) аминокислотных последовательностей белков СОД1 мыши и человека, проводимой при помощи программы ClustalW2, выявлен высокий уровень гомологии двух принадлежащих разным видам белков (рис. 2). В связи с этим в качестве шаблона при построении моделей нативного и мутантного белков использовали структуру мышиной молекулы СОД1, в активных центрах обеих субъединиц которой содержатся ионы цинка.

Далее аминокислотные остатки в структуре шаблона замещали остатками моделируемого белк

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком