МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 4, с. 719-725
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 577.27
МУТАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ ПЕТЛЕВЫХ УЧАСТКОВ ЧЕТВЕРТОГО ДОМЕНА ФАКТОРА ЭЛОНГАЦИИ G В РИБОСОМНОЙ ТРАНСЛОКАЦИИ
© 2003 г. А. В. Колесников, А. Т. Гудков*
Институт белка Российской академии наук, Пущино, Московская обл. 142290 Поступила в редакцию 18.11.2002 г.
С использованием полимеразной цепной реакции получены семь вариантов фактора элонгации G (EF-G) из Thermus thermophilus с мутациями в петлевых участках четвертого домена. Ни одна из точечных мутаций (Arg-504 —- Thr, Pro-554 —- Thr и Ile-534 —► Asp) не повлияла на GTPазную и транслокационную активность EF-G. Аналогичный результат получен в фактор-зависимом гидролизе GTP мутантными белками со вставками тетра- или гексапептидов в двух петлевых участках на вершине и двух петлях в основании четвертого домена. Однако вставка тетрапептида Gly-Ser-Gly-Thr в петлю между остатками 501-504 на вершине домена привела к значительному снижению активности белка в поли(и)-зависимом синтезе полифенилаланина на рибосомах и двукратному снижению транслокационной активности фактора. Этот результат свидетельствует о важности ин-тактной конформации петли Thr-501-Gly-Gly-Arg-504 для стерически точного и эффективного взаимодействия фактора с рибосомой. Анализ структурных и биохимических данных для 30S субчастицы и EF-G позволил уточнить расположение фактора на рибосоме относительно ее 30S и 50S субчастиц.
Ключевые слова: фактор элонгации G, мутагенез, трансляция, структура, функция, Thermus thermophilus.
Фактор элонгации G (EF-G) принадлежит к семейству G-белков, функция которых зависит от связывания и гидролиза GTP. В комплексе с GTP EF-G связывается с рибосомой и катализирует сопряженное перемещение (транслокацию) мРНК на один кодон и тРНК в рибосоме. Следует отметить, что рибосома способна к медленной транслокации и в отсутствие EF-G [1]. Иными словами, способность к транслокации присуща рибосоме, а EF-G в комплексе с GTP или его нерасщепляемым аналогом взаимодействует с рибосомой и сильно стимулирует транслокацию. При этом гидролиз GTP необходим для диссоциации фактора от рибосомы [2].
Пространственная структура EF-G из Thermus thermophilus определена как без гуанилового нук-леотида, так и в комплексе с GDP [3, 4]. Молекула фактора состоит из 691 аминокислотного остатка, и в его третичной структуре отчетливо выделяются пять доменов (рис. 1а). Нуклеотид-связываю-щий домен I (или G-домен) содержит все свойственные G-белкам структурные мотивы, участвующие в связывании GTP и его гидролизе до GDP [5]. Укладка элементов структуры домена II анало-
Принятые сокращения: EF - фактор элонгации; ПЦР - по-
лимеразная цепная реакция.
* Эл. почта: gudkov@vega.protres.ru
гична топологии соответствующего домена фактора Tu. Пространственное расположение доменов III, IV, V и их общая форма похожи на амино-ацил-тРНК в комплексе с фактором Tu и GTP [6]. При этом дистальный конец (вершина) четвертого домена EF-G соответствует положению анти-кодоновой петли тРНК. Такое сходство вызвало предположения о важности этого домена для транслокации [6, 7].
Ранее мы показали, что интактная конформа-ция петли в районе остатков His-573 и Asp-576 четвертого домена фактора важна для транслокационной активности EF-G [8]. В данном сообщении приведены результаты изучения функциональной роли остальных четырех петель в домене IV.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
В работе использовали эндонуклеазы рестрикции фирм "MBI Fermentas" (Литва), "Promega" (США) и "Amersham" (Англия), Vení-полимеразу ("NEB", США).
Синтез олигонуклеотидов осуществляли на синтезаторе "Gene Assembler Plus" ("Pharmacia", Швеция) согласно рекомендациям фирмы. Хро-матографические носители: DEAE Sepharose fF и Phenyl Sepharose ("Pharmacia", Щвеция), HA-Ultro-gel ("IBF", Франция).
Рис. 1. Схема расположения ЕБ-О на рибосоме (а) и домен IV крупным планом (б). Петли обозначены в порядке (сверху вниз от читателя) 11е-534, А1а-573, А^-504, А^-519 и Рго-554.
Работу с рекомбинантными ДНК проводили согласно [9].
Олигонуклеотиды, использованные в работе.
Фланкирующие праймеры:
1. 5 '-CGGTGGTGCATATGGCGGTCAAGGTAG-3', комплементарен 3'-концу нижней цепи гена (NdeI);
2. 5'-GCGAATTCTATTGACCCTTGATGAGC-3', комплементарен концу кодирующей цепи гена (EcoRI).
Мутагенные праймеры:
3. 5 '-CCGGCGGTACCGGCCAGTAC-3' - для введения мутации Arg-504-Thr, комплементарен матричной цепи гена (KpnI);
4. 5 '-GTACTGGCCGGTACCGCCGGT-3' - для введения мутации Arg-504-Thr, комплементарен кодирующей цепи гена (KpnI);
5. 5 '-GGGCGGGGTCGACCCCAAGGAGTAC-3' - для введения мутации Ile-534-Asp (SalI);
6. 5'-GGTACCTCCGGCGGCTCGGGCTTTGA-
3' - для введения вставки из четырех аминокислотных остатков, комплементарен матричной цепи гена (KpnI);
7. 5'-GCCGGAGGTACCCCGGGGGGGGGC-3' -
для введения вставки из четырех аминокислотных остатков, комплементарен кодирующей цепи гена (KpnI);
8. 5'-GCAGTCCGGTACCCTTATCGGC-3' - для введения мутации Pro-554-Thr (KpnI).
Олигонуклеотиды для получения дуплексов:
9. 5 -TCGACGGTACCGGCTCCG-3' - для введения вставки из шести аминокислотных остатков, соответствует кодирующей цепи (KpnI);
10. 5-TCGACGGAGCCGGTACCG-3' - для введения вставки из шести аминокислотных остатков, соответствует матричной цепи (KpnI);
11. 5 -CGGATCCGGTAC-3' - для введения вставки из четырех аминокислотных остатков (BamHI).
Выделены некомплементарные нуклеотиды для введения точечных мутаций и области вставок, подчеркнуты сайты рестрикции эндонукле-аз, названия которых приведены в скобках.
Мутагенез и клонирование генов EF-G. Все
точечные мутации вводили в ген EF-G дикого типа T. thermophilus, клонированный в плазмиду pET11c ("Novagene", США) [10] с использованием ПЦР.
Во всех случаях в первом раунде ПЦР реакционная смесь (100 мкл) содержала 1 мкг плазмиды, 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифос-фата, 0.75 мкМ праймеров и 2 ед.акт. Vent-поли-меразы. Реакции проводили в буфере следующего состава: 10 мМ KCl, 20 мМ Трис-HCl (pH 8.8 при 25°С), 10 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgSO4, 0.1% Triton X-100. Условия проведения первого раунда ПЦР: 30 с, 95°С; 35 с, 30-60°С (в зависимости от температуры отжига праймеров); 30 с - 2 мин, 72°С (в зависимости от длины получаемых фрагментов), 17 циклов.
Точечные мутации Ile-534-Asp и Pro-554-Thr вводили через стадию образования мегапрайме-ров. В первом раунде ПЦР с праймеров 2 и 5 или 2 и 8, соответственно, с плазмиды р^3, как описано в работе [10], получали фрагменты длиной около 500 и 440 п.н. с мутациями, которые использовали в качестве мегапраймеров во втором раунде. Полученные таким образом мутантные гены EF-G длиной примерно 2100 п.н. обрабатывали рестриктазами NdeI и EcoRI и лигировали по соответствующим сайтам в плазмиду рЕТ11с, заменяя ген дикого типа на мутантный. Наличие мутаций подтверждали по возникновению уникальных сайтов SalI или KpnI, введенных при мутагенезе.
В случае точечного мутагенеза Arg-504 —► Thr и инсерции четырех аминокислотных остатков между Arg-519 и Gly-520 использовали сплайсинг-ПЦР [11]. На первом этапе для наработки короткого и длинного фрагментов проводили два независимых раунда ПЦР. В случае Arg-504 —► Thr с плазмиды pLS3 получали фрагменты размером примерно 580 п.н. (праймеры 2 и 3) или 1520 п.н. (праймеры 1 и 4), а в случае мутации в петле 517— 519 - около 520 п.н. (праймеры 2 и 6) или 1580 п.н. (праймеры 1 и 7). Во втором раунде попарно проводили сплайсинг-ПЦР с полученных фрагментов без добавления фланкирующих праймеров, в результате чего достраивались полноразмерные гены EF-G с нужными мутациями. Реакционная смесь в обоих случаях содержала 200 мкМ дезок-сирибонуклеозидтрифосфатов, 0.5 мкг каждого продукта первого раунда ПЦР и 1 ед.акт. Vent-по-лимеразы. Условия проведения реакции: 30 с, 95°С; 35 с, 30-46°С (инкремент - +0.8°С); 2 мин 50 с, 65°С, 20 циклов. После обработки NdeI и EcoRI гены клонировали в плазмиду рЕТ11с. В обоих случаях мутации выявляли по возникновению уникального сайта KpnI.
Для получения конструкций мутантных генов со вставками в участки, кодирующие петли 501504, 530-534 и 554-556, плазмиды с соответствующими генами с точечными мутациями линеаризовали по сайтам KpnI или Sali, возникшим при мутагенезе, и лигировали с олигонуклеотидными дуплексами. Олигонуклеотиды 9 и 10 денатурировали при 85°С в течение 10 мин, а затем отжигали 1 ч до 4°С для формирования дуплексов и вводили в реакцию примерно в 1000-кратном молярном избытке по отношению к вектору. Олигонуклеотиды 9 и 10 использовали для получения вставки в петлю 530-534, а олигонуклеотид 11 - в петли 501-504 и 554-556.
Экспрессия генов мутантных факторов и выделение белков. Гены, клонированные в плазмиду рЕТ11с, экспрессировали с использованием системы Штудиера [12] в штамме Escherichia coli B834(DE3) и среде LB. Растущие клетки индуцировали изопропил-тио^-В-галактозидом при плотности А1 см, 550 = 0.8-1. После индукции клетки росли еще 3-4 ч. Собранные клетки разрушали на прессе, для уменьшения вязкости лизата добавляли ДНКазу I (1 мкг/мл). Сразу же после разрушения к клеточному лизату добавляли фенилметил-сульфонилфторид (1 мкг/мл). Затем последовательно получали фракции S-30 (30000g, 40 мин) и S-100 (100000g, 3 ч). Супернатант наносили на колонку с DEAE Sepharose Ff, уравновешенную буфером А (60 мМ Трис-HCl, рН 7.6, 1 мМ EDTA, 5 мМ ß-меркаптоэтанол), и элюировали белки 400 мл линейного градиента NaCl (0-0.5 М) в этом же буфере. Поскольку все мутантные белки T. thermophilus сохранили термостабильность, присущую фактору G дикого типа, при их выделении
применяли тепловую денатурацию белков E. coli. [10]. С этой целью объединенную фракцию с EF-G после DEAE Sepharose инкубировали 15 мин при 72°С. После осветления к супернатанту добавляли (NH4)2SO4 до 15% насыщения и наносили на колонку с Phenyl Sepharose. Элюировали 150 мл буфера А, при этом концентрацию (NH4)2SO4 в нем уменьшали от 15% насыщения до 0%. Фракции с EF-G объединяли, переводили в буфер В (5 мМ NaH2PO^/Na2HPO4, рН 7.6) и наносили на колонку с НА-Ultrogel. Белки
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.