ГЕНЕТИКА, 2009, том 45, № 9, с. 1194-1202
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =
УДК 579.252:579.842.11
МУТАЦИЯ В КЛАСТЕРЕ ГЕНОВ cspH-cspG ПОВЫШАЕТ ЭКСПРЕССИЮ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА И SOS-СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИ
Escherichia coli
© 2009 г. В. Н. Вербенко, Л. В. Кузнецова, Л. А. Лучкина, Н. В. Клопов
Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Российской академии наук, Ленинградская обл., Гатчина 188300; e-mail: verbenko@omrb.pnpi.spb.ru Поступила в редакцию 07.07.2008 г.
Рецессивный аллель радиорезистентности gam12, клонированный на плазмиде pBC4042-gam12, незначительно повышает радиоустойчивость клеток E. coli дикого типа. В то же время у-облучение индуцирует переход мутации gmr12 в гомозиготное состояние и увеличивает устойчивость таких клеток в 3.37 раза. Мутация gmr12 картируется на 22.68 мин хромосомы в области кластера генов белков холодового шока cspH-cspG. Секвенирование аллеля gam12 обнаружило последовательность гена холодового шока cspG и наличие инсерций в С-концевой части гена. Трансляция мутант-ного гена cspG может приводить к синтезу укороченного продукта, представляющего N-концевой фрагмент белка, содержащий мотивы связывания с ДНК и РНК. Анализ генома E. coli обнаружил последовательности, узнаваемые белками семейства cspA, в генах холодового шока, теплового шока, SOS-регулона и других систем. Полученные данные говорят о возможном участии мутантных РНК-шаперонов типа CspA' и CspG' в экспрессии ключевых генов системы SOS-репарации и рекомбинации и дополнительных стрессовых систем, включая белки теплового шока, в радиоустойчивых мутантах E. coli.
Система белков холодового шока (БХШ), главным компонентом которой является белок CspA [1], обеспечивает адаптацию бактериальных клеток к пониженной температуре, регулируя экспрессию целого ряда генов. Она же оказывает влияние на радиационную чувствительность клеток. Холодовой шок (при переносе с 37° на 10°C) увеличивает количество белка RесA в 3 раза и GyrA (субъединица A ДНК-гиразы) в 2 раза [2]. RесA является ключевым компонентом нескольких ветвей репарации ДНК. Кроме того, при переносе клеток на пониженную температуру усиливается экспрессия белков холодового шока Hsc60 и HscB (гомологов белков теплового шока (БТШ) - DnaK и DnaJ) [3] и белков теплового шока GroEL, GroES, ClpB и HtpG [2]. Белки теплового шока выполняют вспомогательную функцию в репарации [4]. Изменение экспрессии системы белков холодового шока может модифицировать ответ клеток E. coli на летальное действие радиации. Одна из немногих известных к настоящему времени мутаций, затрагивающих ген cspA у E. coli, способна в гетерозиготном (только на плазмиде) и в гомозиготном (и на плазмиде, и в клеточной хромосоме) состоянии значительно повысить устойчивость к радиации клеток E. coli с нормальными системами репарации и синтеза БТШ [5]. Протекторный эффект мутации cspA::kan в присутствии хромосомного гена cspA+ критически за-
висит от генов других стрессовых систем: гена recA+, участвующего в контроле SOS-регулона и гомологической рекомбинации, и гена rpoH+ а-фактора регу-лона белков теплового шока [5].
БХШ могут выступать как активаторы транскрипции, узнавая в днДНК мотивы ССААТ и комплементарный ATTGG, известные как Y-бокс [6], и связываться с онДНК и РНК [7]. Предполагается, что белки семейства CspA могут выступать как антитерминаторы транскрипции [8]. С другой стороны, эти белки могут выступать как РНК-шаперо-ны, кооперативно взаимодействуя с мРНК и дестабилизируя двунитевые структуры, образующиеся при низкой температуре [9]. Механизм регулятор-ного действия БХШ на другие стрессовые системы до конца не изучен.
Радиоустойчивый мутант E. coli Gamr444, у которого повысилась эффективность SOS-системы репарации на фоне гиперпродукции БТШ [10], по-видимому, имеет дополнительную регуляцию системы репарации и высокомолекулярных белков-шаперонинов и АТФ-зависимых протеаз. Целью данной работы стала проверка предположения, что повышенная радиорезистентность может быть связана с экспрессией мутантных белков холодового шока субсемейства CspA.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы Е. coli. В работе использованы штаммы E. coli K-12: АВ1157 (F- ara14 galK2 his-4 proA2 argE3 thil tsx33 thrl leu6 lacYl mtll xyl5 rpsL31 supE37), содержащий фаг Mu+, и Z905 (ArecA Mu+)/pBC4042-gam12.
Плазмиды. В работе использована плазмида pBC4042-gam12, полученная в Отделении молекулярной и радиационной биофизики ПИЯФ РАН [11]. Плазмида несет детерминант Cmr устойчивости к хлорамфениколу и является производным вектора pBC4042 (Apr, Cmr) [12], полученным путем рекомбинационной замены маркера Apr на фрагмент хромосомной ДНК радиоустойчивого штамма E. coli Gamr 444 длиной ~ 2500 пн, содержащий рецессивный аллель радиоустойчивости gam12 [11].
Среды. Для у-облучения клеток использовали фосфатный буфер М9, содержащий 0.05 М MgSO4, Na2HPO4 (6 г), КН2РО4 (3 г), NaCl (0.5 г), NH4Cl (1 г) на 1 л воды (рН 7.2). Для выращивания клеток применяли АП-бульон - аминопептид, разбавленный в 2 раза 0.15 М NaCl. Титрование клеток проводили на АП-агаре (АП-бульоне, содержащем 1.6% агара). Хлорамфеникол добавляли в среды в концентрации 25 мкг/мл.
Выделение плазмидной ДНК. ДНК плазмиды pBC4042-gam12 выделяли стандартным методом щелочного лизиса [13].
Трансформацию клеток E. coli проводили кальциевым методом по стандартной методике [13] и высевали на АП-агар с хлорамфениколом.
Отбор клонов, гомозиготных по рецессивной мутации gam12. Для селекции клонов, гомозиготных по аллелю gamr12, трансформант AB1157/pBC4042-gam12 облучали 5 раз увеличивающимися дозами у-лучей и отбирали радиорезистентные варианты [11].
Изучение зависимости выживаемости клеток от дозы у-излучения. Клетки E. coli, выращенные в АП-бульоне до середины экспоненциальной фазы роста (оптическая плотность при 630 нм равна 0.2-0.4), осаждали центрифугированием (10000 об/мин, 10 мин) и ресуспендировали в исходном объеме буфера М9. Облучение производили при 4°C в пробирках в ледяной бане на установке "Исследователь" у-лучами 60Со при мощности дозы 20 Гр/мин. Облученные клетки после соответствующего разбавления буфером М9 рассевали на АП-агар и подсчитывали число колоний через 24 ч. С каждым из использованных штаммов проведено по 3-6 независимых экспериментов.
Гибридизация ДНК рекомбинантной плазмиды с хромосомной библиотекой E. coli. Для картирования мутации gamr12 проводили гибридизацию рекомбинантной плазмиды pBC4042-gam12 с упорядоченными клонами, содержащими фраг-
менты ДНК E. coli и иммобилизованными на мембране Escherichia coli Gene Mapping Membrane производства Takara Shuzo Co (Япония). ДНК плазмиды pBC4042-gam12 метили по стандартной методике мечения ДНК со случайными прайме-рами [14], используя препарат [а^^-дСТФ ("Изотоп", Санкт-Петербург) с молярной активностью 148 пБк/моль. Прегибридизацию проводили 1 ч при 65°С в ~ 20 мл раствора, содержащего 50% формамида, 5 мл 5-кратного буфера SSPE, 2 мл 100-кратного раствора Денхардта, 2 мл 1%-ного додецилсульфата натрия и 0.4 мл раствора негомологичной ДНК (200 мкг/мл), которая была перед добавлением в раствор денатурирована прогреванием при 100°С 5 мин и охлаждена на льду. 20-кратный буфер SSPE содержал 3.6 М NaCl, 0.2 M Na3PO4 и 0.02 M EDTA при pH 7.7. 100-кратный раствор Денхардта содержал 2% (вес/объем) бычьего сывороточного альбумина, 2% (вес/объем) фикола, 2% (вес/объем) поливи-нилпирролидона. Меченая проба (удельная активность ~108 распадов/мин мкг) подвергалась денатурации 5 мин при 100°С, а затем добавлена в прегибридизационный раствор. Инкубировали 12 ч при 65°С. Фильтры отмывались 2-кратным SSPE с 0.1%-ным додецилсульфатом натрия при комнатной температуре 10 мин. Раствор меняли на 0.1-кратный с 0.1%-ным додецилсульфатом натрия и инкубировали при 65°С 10 мин. Мембрану высушивали и выполняли радиоавтографию.
Полимеразная цепная реакция. Для амплификации клонированного фрагмента использовали прай-меры производства "Синтол" (Москва) к флангам плазмидного вектора: прямой праймер mugC-F3 5'-AATACATCTGTTTCATTTGAAGCGC и обратный праймер musI-R3 5'-CGGCATAAGCTGATTTGTGA. Для подтверждения присутствия на плазмиде локуса cspG амплификация проводилась с использованием праймеров: cspG-F4 5 '-CGACCGTCGGAGGG-GATAAT и cspG-R4 5'-TAACAACGTTCGCTGC-CGCG и Taq ДНК-полимеразы производства "Сиб-энзим" по инструкции производителя на ДНК-ам-плификаторе Eppendorf MasterCycler Personal.
Секвенирование и анализ геномной ДНК. Се-квенирование ДНК проводили на секвенаторе ABI Prizm 370 в фирме "Хеликс" (Санкт-Петербург) с использованием праймеров cspH-F5 5'-TAATAGCTGCGTCGGTTTGA и cspG-R5 5'-CATGGTCAGTGCGTATTTGC. Анализ секве-нированных последовательностей проводили с помощью программы BLASTN Национального центра биотехнологической информации (США). Анализ распределения в геноме E. coli последовательностей, узнаваемых белками Y-блока, делали с помощью программы Search, написанной в ПИЯФ РАН Н.В. Клоповым.
Математическая обработка результатов опытов. Обработка данных о зависимости выжи-
lgS
Рис. 1. Летальное действие у-излучения на штаммы АВ1157 (1), AB1157/pBC4042-gam12 (2) и AB1157/pBC4042-gam12 после 5 циклов у-облучения-подращивания (3). По оси абсцисс - доза, кГр; по оси ординат - выживаемость (^ 5).
ваемости клеток (5) от дозы у-излучения (О) и построение дозовых кривых выживаемости ^ 5 = =/(О) проведены методом наименьших квадратов. Кривые ^ 5 = /(О) линейно аппроксимировались как ^ 5 = А + ВО.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Рецессивная мутация gamr12, клонированная на плазмиде pBC4042, в гетерозиготном состоянии вызывает незначительное увеличение радиоустойчивости клеток дикого типа E. coli AB1157 с плазмидой pBC4042-gam12 (рис. 1), и радиозащитный эффект становится заметным только в области больших доз. После пяти последовательных у-облучений наблюдается значительный рост радиоустойчивости с фактором изменения дозы, равным ~3.37 (рис. 1). По-видимому, радиация вызывает гомогенотизацию и переход от мероди-плоида к gamr12/gamr12, так как известно, что облучение клеток E. coli recA+ с высокой частотой вызывает перенос аллелей из плазмид на хромосому [15].
Сл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.