ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
МЫШИНЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ РИЦИНА НЕ РЕАГИРУЮТ С АГГЛЮТИНИНОМ РИЦИНА
Е.Н. Попова1, Ш.Ю. Хапчаев2, С.Г. Егорова2, И.А. Демина3, О.А. Бенедиктова2, И.И. Агапов1, М.М. Мойсенович2
1 ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва, Россия; 2 Московский государственный университет, Москва, Россия; 3 Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ, Москва, Россия
Поступила: 10.09.05 г. Принята: 16.10.07 г.
Получено 6 новых моноклональных антител, связывающихся с каталитической субъединицей рицина в составе голотоксина. Охарактеризовано взаимодействие этих антител с рицином, его А-субъединицей, агглютинином рицина, а также гетеродимерами (АВ) агглютинина рицина с помощью ELISA. Проведен первичный эпитопный анализ с помощью сэндвич-ELISA. Полученные результаты свидетельствуют о том, что каждые из описываемых антител направлены к индивидуальному антигенному эпитопу А-субъединицы рицина, причем 5 из 6 визуализируемых данными антителами эпитопов отсутствуют у А-субъ-единицы агглютинина рицина. На основе пары антител 1RK2/2RK1 создана тест-система, позволяющая с помощью сэндвич-ELISA выявлять менее 1нг рицина.
Ключевые слова: гибридома, моноклональные антитела, рицин, агглютинин рицина
ВВЕДЕНИЕ
Структура рицина (Я60) — токсина из семян клещевины, детально изучена с помощью рентгеноструктурного анализа [1]. Молекулу рицина составляют две субъединицы: А (ЯТЛ) — каталитическая и В (ЯТБ) — лектиновая, соединенные одной дисуль-фидной связью между 259 в ЯТЛ и 4 в ЯТБ остатками цистеина. ЯТЛ — Ы-гликозидаза, субстратом которой является рибосомаль-ная 288 РНК эукариот. Ферментативная активность ЯТЛ приводит к инактивации рибосом и, как следствие, необратимой остановке синтеза белка и гибели клетки [2]. ЯТБ обеспечивает связывание токсина с гликолипидами и гликопротеинами клеточной поверхности. Связанный с рецептором рицин интернализуется в клетку путем эн-доцитоза [3, 4]. Точный «маршрут» Я60 от поверхности до цитоплазматической мишени в клетке не известен. Предполагается, что токсин из эндосом попадает в аппарат Гольджи, затем ретроградно транспортируется в эндоплазматический ретикулум, где происходит восстановление дисульфидной
Адрес: 113545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1 ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов. E-mail: K_Popova_Ch@mail.ru
связи между его субъединицами и транслокация ЯТЛ в цитозоль [5, 6, 7].
Кроме Я60 в семенах клещевины содержится его ближайший родственник — агглютинин рицина (Я120). Ш20 — тетрамер, состоящий из двух рициноподобных диме-ров, соединенных дисульфидной связью, образованной Сув156 А субъединиц [8]. Гомология аминокислотной последовательности субъединиц Я60 и Я120 составляет 93% для А-цепей и 81% для В-цепей [9]. Рентгено-структурный анализ Я60 и Я120 не выявил серьезных структурных различий между субъединицами этих белков [8]. Однако, почти все аминокислотные остатки, по которым различаются А-субъединицы этих токсинов локализованы на поверхности глобулы ЯТЛ. Рентгеноструктурный анализ позволяет получать самую детальную информацию о строении молекулы белка, однако условия кристаллизации не соответствуют природным условиям, в которых белок проявляет свою активность.
Антигенные детерминанты представляют собой участки поверхности молекулы, обладающие физико-химическими свойствами, позволяющими им эффективно некова-лентно связываться с антигенсвязывающи-ми центрами антител, а также с другими соответствующими им структурами. Среди
этих структур могут оказаться внутриклеточные элементы, связанные с транспортом белков.
В настоящей работе описываются 6 новых мышиных моноклональных анти-RTA антител, реагирующих с рицином. Эпито-пы, против которых направлены полученные мАТ, не идентичны, хотя некоторые из них частично перекрываются. 5 из 6 визуализируемых с помощью мАТ эпитопов отсутствуют как на поверхности R120, так и на поверхности гетеродимеров (АВ) R120. Таким образом, иммунная система мыши дискриминирует R60 от R120. Это находится в строгом соответствии с данными рентгено-структурного анализа, выявляющим на поверхности А-субъединиц этих токсинов не идентичные участки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение токсинов и их субъединиц
R60 и R120 выделяли из семян клещевины (Ricinus communis), разделяли на субъединицы и очищали в соответствии с описанной методикой [11]. RTA дополнительно очищали методом аффинной хроматографии на асиа-лофетуин-сефарозе 4В [10], RTB и R120 — на Rch1-сефарозе-4В (Rch1 — мышиные моно-клональные анти-RTA антитела ранее полученные в нашей лаборатории [10]).
Получение моноклональных антител против рицина
Мышей линии Balb/с (НИИ биомоделей РАМН, Россия) иммунизировали RTA и R60 в соответствии со схемами в табл. 1. Титр антител в сыворотках контролировали при помощи ELISA. Слияние спленоцитов с миеломой линии sp2/0 проводили на третий день после бустерной иммунизации. Миелому выращивали на среде RPMI 1640 (Sigma, USA), первичные гибридомы — на среде НАТ (Sigma, USA). В случае иммунизации животных RTA по схеме 1 (табл. 1) для отбора устойчивых к рицину гибридом в среду НАТ добавляли 10-12 и 10-11 М R60. Супернатанты скриниро-вали при помощи ELISA с биотинилирован-ными R60, RTA и RTB в растворе. Полученные гибридомы были разделены на три группы в зависимости от реакции их супернатантов с антигенами (табл. 1). Отобранные гибридомы многократно клонировали методом лимитирующих разведений. мАТ накапливали в ас-
цитной жидкости и выделяли методом аффинной хроматографии на протеин А-сефа-розе (Pharmacia, Sweden).
Системы ELISA
1. На иммунологическую плашку сорбировали нативные или предобработанные в течение часа 5 мМ дитиотреитолом (ДТТ) антигены (RTA, R60 или R120). Инкубировали с BSA, затем с мАТ против R60, потом с комплексом кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши с пероксидазой хрена (IMTEK, Россия).
2. На плашку иммобилизовали антитела против RTA и R60 непосредственно (в случае мАТ) или через кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (IMTEK, Россия) (в случае сывороток и супернатантов). После забивки плашки BSA и инкубации с сыворотками или супернатантами гибридом (в случае работы с чистыми мАТ этот шаг отсутствовал) последовательно проводили реакции с биоти-нилированными антигенами (1 мкг/мл; RTA, R60 или R120) и с комплексом стрептавидин-пероксидаза (IMTEK, Россия).
3. На иммунологическую плашку сорбировали первые мАТ. После инкубации с BSA последовательно проводили реакции с антигенами (R60, RTA или R120), вторыми биотини-лированными мАТ (1 мкг/мл) и конъюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена.
Таблица 1. Протоколы иммунизации
Протокол иммунизации 1 Протокол иммунизации 2
0 день RTA 5 мкг в FCA RTA 5 мкг в FCA
14 день RTA 5 мкг в FIA R60 1 мкг в FIA
22 день RTA 5 мкг в PBS R60 1 мкг в PBS
29 день RTA 5 мкг в PBS R60 1 мкг в PBS
57 день RTA 2 мкг в PBS R60 1 мкг в PBS
92 день R60 1 мкг в PBS
мАТ 1RAK-1, 1RAK-2, 2RK-1, 2RK-2,
1RAK-3, 1RAK-4, 2RK-3*, 2RBK-1**
1RAK-5, 1RAK-6***,
1RK-1, 1RK-2, 1RK-3*.
* мАТ группы ЯК, реагировали с растворенными ЯТЛ и Я60;
** мАТ 2ЯВК1 реагировали с растворенными ЯТВ и Я60;
*** мАТ группы ЯЛК реагировали только с растворенным ЯТЛ.
Белки сорбировали на 96 луночный планшет (Costar, USA) в PBS (по 1 мкг в лунку). Реакции проводились в стандартных условиях. Калориметрические измерения проводили при 492 нм.
Диссоциация субъединиц рицина и R120
Диссоциацию субъединиц R60 и R120 детектировали с помощью аналитической гель-фильтрации на колонке «Superdex-75HR» (Pharmacia, Sweden) (10x300 мм) в системе FPLC. Для уравновешивания колонки и элю-ции белков использовали PBS с 20 мМ a-D-ла-ктозой. Токсины инкубировали в течение часа в присутствии 5 мМ ДТТ при комнатной температуре, наносили на колонку при скорости потока 1 мл/мин и регистрировали время элюции белков.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Взаимодействие мАТ группы RK с RTA, R60 и R120 в ELISA
Взаимодействие мАТ группы RK с антигенами изучали в двух системах ELISA. В одной системе антигены иммобилизовали на плашку, в другой — биотинилированные антигены находились в растворе. Конформация белка, сорбированного на иммунологическую плашку, отличается от конформации нативного белка. Это связано с тем, что иммобилизация происходит за счет нековалентных взаимодействий боковых цепей аминокислотных остатков белка с пластиком [12]. Следствиями изменения конформации могут быть как нарушение структуры антигенных детерминант нативного белка, так и появление новых антигенных детерминант. В зависимости от выбора системы ELISA мАТ, направленные к этим детерминантам, будут по-разному реагировать с антигеном. Такие мАТ были описаны ранее для субъединиц вискумина, родственного рицину токсина из листьев омелы белой [12, 13].
Для оценки специфичности мАТ группы RK мы изучали их связывание не только с R60 и RTA, которыми иммунизировали животных, но и с R120. Гомология А-цепей R60 и R120 составляет 93% [9], что является предпосылкой для перекрестной реакции полученных антител с R120.
Все антитела группы RK реагировали с биотинилированными рицином и его А-це-
пью, а также с иммобилизованным на плашке рицином (рис. 1, 2). С иммобилизованной на плашке RTA не реагировали только антитела 2RK3. Два мАТ, 1RK1 и 2RK1, взаимодействовали с иммобилизованным на плашке R120. Только а Антитела 1RK1 взаимодействовали с биотинилированным R120 в растворе. Таким образом, анализ взаимодействия полученных антител с антигенами в двух системах ELISA позволил выделить три мАТ, направленных к уникальным эпито-пам: 1RK1, 2RK1 и 2RK3.
Анализ антител группы RK в сэндвич-ELISA. Тест-системы для определения рицина в биологических образцах
Антитела группы RK конъюгировали с био-тинамид-Ы-гидроксисукцинимидным эфиром и проанализировали в сэндвич-ELISA во всех возможных вариантах с рицином в качестве антигена. Всего было проанализировано 30 вариантов для 15 пар антител. Результаты анализа представлены в табл. 2.
Данные о взаимодействии полученных антител с антигенами позволили нам сделать вывод об уникальности эпитопов дл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.