МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 4, с. 472-478
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.222.4
НАЧАЛЬНЫЕ ЭТАПЫ ТРАНСФОРМАЦИИ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА МИКРООРГАНИЗМАМИ
© 2004 г. С .А. Зарипов1*, А. В. Наумов**, Е. С. Суворова**, А. В. Гарусов*, Р. П. Наумова*
*Казанский государственный университет **Университет штата Монтана, Боземан, США Поступила в редакцию 15.04.03 г.
На основе скрининга широкого круга микроорганизмов (32 штамма), выделенных из антропогенных и природных экологических ниш, а также коллекционных штаммов, показано, что начальные этапы трансформации 2,4,6-тринитротолуола (ТНТ) большинством изученных нами микроорганизмов сопряжены с образованием изомерных гидроксиламинодинитротоуолов (ГАДНТ) количество которых в ряде случаев сопоставимо с исходным ТНТ. Альтернативная восстановительная атака ТНТ, заключающаяся в востановлении его ароматического ядра, нехарактерна для большинства исследованных прокариот. Получены данные в пользу гипотезы о разной чувствительности грам-положительных и грамотрицательных бактерий к токсическому действию ТНТ.
Ключевые слова: 2,4,6-тринитротолуол, начальная трансформация, гидроксиламинодинитротолуолы.
Охрана окружающей среды и природных ресурсов от загрязнения веществами антропогенного происхождения, способными аккумулироваться в живых организмах и вызывать нежелательные изменения обменных процессов, является актуальной проблемой современности.
Среди синтетических веществ, загрязняющих биосферу, большую категорию представляют ароматические нитросоединения, к которым относится 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ). Большое количество ТНТ было произведено во время Второй мировой войны, однако значительная часть этого загрязнителя почвы сохранилась до настоящего времени. Даже по истечении 50 лет после загрязнения почвы ТНТ обнаруживался в ней в значительных концентрациях, вплоть до 9600 мг/кг [1]. Столь медленная скорость биологической трансформации и биодеградации ТНТ может свидетельствовать о подавлении ксенобиотиком метаболической активности микроорганизмов.
Основным путем биотрансформации ТНТ является его восстановительное превращение. Согласно данным многих авторов, большинство аэробных бактерий осуществляют его восстановление с образованием моноаминопроизводных. Восстановление ТНТ до 2,4,6-триаминотолуола зафиксировано лишь у строго анаэробных микроорганизмов [2]. C другой стороны, серия исследований выявила возможность образования гидроксиламинодинитрото-луолов (ГАДНТ), в качестве продуктов биологической трансформации ТНТ [3, 4, 9]. Для ряда микро-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: Sergey.Zaripov@ksu.ru).
организмов описан альтернативный путь начальной трансформации, заключающийся в частичном восстановлении ароматического кольца с образованием гидридного комплекса Мейзенхейме-ра [4-6]. Несмотря на то что ряд исследований продемонстрировал принципиальную возможность частичной минерализации данного соединения [7-9], крайне низкий уровень этой минерализации в естественных и экспериментальных условиях свидетельствует о существовании метаболических барьеров на ключевых этапах превращений. Поэтому актуальным остается решение проблемы ограниченного воздействия большинства микроорганизмов на данный ксенобиотик, а также установление факторов, контролирующих эти процессы и препятствующих минерализации ТНТ и его вовлечению в циклы углерода и азота. Для объективной оценки механизмов, ограничивающих трансформацию ТНТ, необходимо изучить начальные этапы его превращения широким кругом микроорганизмов, поскольку на этих этапах могут образовываться соединения, тормозящие дальнейший метаболизм ТНТ. В этой связи актуальны исследования, направленные на выявление "узких мест", лимитирующих метаболизм ТНТ.
Цель настоящей работы - выявить наиболее характерные для разных групп прокариот механизмы начального воздействия на ТНТ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Микроорганизмы и условия культивирования.
В работе использовали штаммы микроорганиз-
мов из коллекции Лаборатории экологической биотехнологии и биомониторинга Казанского государственного университета, выделенные из различных источников, таких как нефтезагряз-ненная почва, нефтешлам, химически загрязненные воздушные выбросы.
Чувствительность штаммов к ТНТ испытывали культивируя их на жидкой среде А следующего состава (г/л): глюкоза - 5, MgSO4 - 0.25, Na2HPO4 - 4.5, KH2PO4 - 3.0, (NH4)2SO4 - 1.0, дрожжевой экстракт - 0.05 с различными концентрациями ТНТ (15-200 мг/л). ТНТ вносили в виде раствора в этиловом спирте.
Трансформация ТНТ клеточными суспензиями. Штаммы предварительно культивировали до поздней экспоненциальной фазы роста на мясопеп-тонном бульоне, клетки осаждали (5000 g, 15 мин), дважды промывали 16 мМ фосфатным буфером (рН 6.0) и ресуспендировали в том же буфере до оптической плотности А600 = 1.0. ТНТ вносили в виде раствора в этаноле до конечной концентрации 0.44 мМ. Инкубационная смесь содержала 5 мМ глюкозу в качестве исходного источника редуцирующих эквивалентов.
Опыты проводили в колбах объемом 250 мл, содержащих по 50 мл инкубационной смеси, на качалках (120 об/мин)
Трансформация ТНТ в ростовых условиях. Культивирование бактерий проводили во встряхиваемых (120 об/мин) конических колбах емкостью 250 мл, содержащих 50 мл среды А. Концентрация ТНТ в среде соответствовала его максимальному уровню, совместимому с ростом данного штамма. В качестве посевного материала использовали 24-часовые культуры, выращенные на среде А без ТНТ. Оптическая плотность (Ä600) клеточной массы в момент инокуляции составляла 0.02. Контролем служила освобожденная от клеток культуральная жидкости.
После инкубации/культивирования при 28°С клетки осаждали и в супернатанте определяли ТНТ и его метаболиты.
Анализ продуктов трансформации ТНТ осуществляли с использованием жидкостного хроматографа LKB 2150 методом, описанным ранее [4].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Оценка токсического действия ТНТ на рост изучаемых штаммов на жидкой синтетической среде показала, что наиболее устойчивы штаммы грамотрицательных бактерий. Минимальная концентрация ТНТ, полностью ингибирующая их рост (за исключением штамма Pseudomonas sp. EN1561) находилась в диапазоне 100-200 мг/л, в то время как в случае грамположительных штаммов - на уровне 15-100 мг/л (таблица). Заслуживает внимания тот факт, что некоторые изолиро-
ванные нами штаммы грамположительных бактерий обладают большей устойчивостью к изучаемому ксенобиотику, нежели большинство описанных ранее представителей данной группы [10-13].
Поскольку покоящиеся клетки более устойчивы к ТНТ, чем клетки растущих культур, его трансформацию изучали с использованием клеточных суспензий при исходной концентрации ксенобиотика 0.44 мМ. За время эксперимента (5 ч) большинство грамотрицательных бактерий осуществляли превращение большей части (90-100%) этой достаточно высокой концентрации ТНТ (таблица). В свою очередь, грамположительные бактерии трансформировали за то же время лишь 50-80% ТНТ.
На рис. 1 представлена динамика трансформации тНт и аккумуляции основных метаболитов, образующихся на первых этапах его трансформации клеточными суспензиями некоторых штаммов (представлены штаммы, накапливающие максимальное или минимальное количество ГАДНТ среди грамположительных и грамотрицательных бактерий соответственно).
HPLC-анализ инкубационных смесей после отделения клеток позволил выявить характер начальных этапов трансформации ксенобиотика. Наиболее важный феномен, выявленный нами в данной работе, - ограниченное воздействие большинства штаммов микроорганизмов на ТНТ, сопряженное с образованием изомерных ГАДНТ в качестве основных продуктов трансформации (таблица), тогда как уровень образования соединений с хотя бы одной полностью восстановленной нитрогруппой (АДНТ) не превышал 10% от концентрации исходного ксенобиотика, а в большинстве случаев составлял 0-3%.
Что касается возможности четырехэлектронно-го восстановления второй нитрогруппы с образованием дигидроксиламинонитротолуолов (ДиГАНТ), то у двух из изученных нами штаммов (Pseudomonas sp. ZS50, P. aeruginosa ZS31) обнаружена способность к такому восстановлению. Однако полностью исключать возможность образования данного метаболита другими штаммами нельзя, поскольку ДиГАНТ известен своей крайней неустойчивостью в водных растворах [14], поэтому он мог превратиться в другие соединения во время манипуляций, связанных с его идентификацией.
Наряду с масштабным образованием ГАДНТ, заслуживает внимания тот факт, что данные метаболиты обнаруживаются в инкубационных и культуральных жидкостях продолжительное время (более 100 ч). Однако Вангом с соавт. [14] показано, что ГАДНТ нестабильны в водных растворах в присутствии молекулярного кислорода и, вероятно, окисляются до нитрозопроизводных, которые образуют димеры (2.2'-азокси- и 4.4'-азок-
Таблица
Штаммы Источник1 Чувствительность к ТНТ, мг/л2 Трансформировано ТНТ, %3 Метаболиты, мМ
ГАДНТ АДНТ Н-ТНТ
Грамположительные бактерии
Bacillus sp. ZS19 (рис. 1, 3a) 1 50 80 0.08 0 0.04
Bacillus cereus ZS18 1 85 84 0.13 0 0.03
Sarcina sp. IC1 2 100 86 0.25 0.04 0
Sarcina sp. IC2 (рис. 1, 36) 2 100 80 0.31 0.01 0
EN14 1 30 84 0.17 0.02 0.02
EN17 1 50 70 0.18 0.02 0.04
EN1201 1 50 84 0.14 0.05 0
EN811 1 25 86 0.25 0.007 0
Bacillus subtilis JH642 3 15 70 0.04 0.02 0
B. intermedius 7P 3 25 65 0.10 0.003 0
B. circulans BCF-247 3 15 70 0.11 0 0
B. thuringiensis var. subtoxicus 3 35 80 0.13 0.01 0
B. intermedius 10-41 3 15 76 0.13 0.003 0
Грамотрицательные бактерии
Pseudomonas aeruginosa ZS31 3 150 100 0.36 0 0
Pseudomonas fluorescens ZS32 1 200 100 0.37 0.009 0
Pseudomonas putida ZS41 1 100 100 0.38 0.004 0
Pseudomonas sp. ZS50 1 150 100 0.20 0 0.08
Pseudomonas putida ZS61 3 200 100 0.29 0.009 0
Pseudomonas putida ZS71 1 200 100 0.27 0.009 0
Pseudomonas sp. ZS81 1 150 100 0.35 0 0.06
Pseudomonas fluorescens ZS82 3 150 100 0.35 0.004 0
Pseudomonas sp. EN1582 1 200 100 0.24 0 0
Pseudomonas sp. EN1561 4 50 50 0.13 0 0
ZS10 4 100 100 0.35 0 0.08
ZS20 (рис. 1, 3г) 4 150 100 0.41 0 0.02
ZS42 1 125 100 0.40 0 0.03
ZS62 1 150
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.