ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 2, с. IIS-I23
== ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ =
УДК 591.089.84:611.018
НАДФ-ДИАФОРАЗАПОЗИТИВНЫЕ НЕРВНЫЕ КЛЕТКИ В ГЕТЕРОТОПИЧЕСКИХ ТРАНСПЛАНТАТАХ СПИННОГО МОЗГА1
© 2004 г. Е. С. Петрова, В. А. Отеллин
ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН 197376 Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12 Поступила в редакцию 25.12.02 г. Оконательный вариант получен 21.07.03 г.
Метод эктопической трансплантации эмбриональных закладок центральной нервной системы позволяет изучать механизмы адаптации пересаженных эмбриональных закладок. Одним из таких механизмов считается продукция клетками окиси азота. Показателем присутствия в клетках синтазы окиси азота является НАДФ-диафораза. В настоящем исследовании установлено, что нервные клетки трансплантатов эмбрионального спинного мозга крыс сохраняют способность экспрессиро-вать НАДФ-диафоразу после пересадки в седалищный нерв взрослых животных в течение 6 мес. Проведено сравнительное исследование динамики развития НАДФ-диафоразапозитивных нейронов эмбрионального спинного мозга крыс, развивающегося в условиях трансплантации и in situ. В шейном отделе спинного мозга мелкие биполярные НАДФ-диафоразапозитивные нейроны выявляются на 17-е сут пренатального развития. Установлено, что в условиях трансплантации эмбрионального (15-е сут развития) спинного мозга в нерв формирование НАДФ-диафоразапозитивных нейронов начинается позже, чем in situ, через 7 сут после пересадки. Результаты гистохимического исследования через 6 мес после операции демонстрируют протективную роль НАДФ-диафоразы в нейронах аллотрансплантатов, развивающихся в условиях измененного микроокружения и недостаточной иннервации, а также позволяют предположить, что окись азота может вызывать гибель нейронов в длительно живущих трансплантатах.
Ключевые слова: спинной мозг, нерв, нейротрансплантация, окись азота.
Метод трансплантации эмбриональных закладок ñHC нашел широкое применение для изучения их гистогенеза и взаимоотношений с тканями реципиента (Bjorklund et al., 1976, 1985; Das, Hallas, 1978; Das, 1985; Виноградова, 1985; Полежаев, Aлeксaндрoвa, 1986; Отеллин и др., 1990; Полежаев и др.,1993; Aлeксaндрoвa, 1999; ^мченко и др., 2000). Эктопическая трансплантация эмбриональных закладок мозга в переднюю камеру глаза (Olson et al., 1988; Брагин, 1990; Журавлева, 1999), периферический нерв (Bernstain, 1983; Чу-масов, Петрова, 1990), семенник (Дыбан, 1989), слюнную железу (Чумасов и др., 1988) позволяет выявлять механизмы адаптации пересаженных эмбриональных закладок. В качестве одного из таких механизмов рассматривается синтез клетками окиси азота (NO). Показателем присутствия NO-синтазы (NOS) в клетке может служить HAДФ-диaфoрaзa (HAДФ-д). В настоящее время известно, что NO регулирует физиологические функции многих систем организма, в том числе и деятельность ñHC. Установлено, что NO является межклеточным мессенджером, участвует в ре-
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 01-04-48819).
гуляции мозгового кровотока, а также служит протектором нервных клеток при повреждении (Bredt, Snyder, 1994; Реутов и др., 1997; Dawson V., Dawson T., 1998; Estevez et al., 1998). Роль NO в развивающемся мозгу мало изучена, немногочисленны также исследования о формировании НАДФ-д-позитивных нервных клеток в нейро-трансплантатах (Shoham et al., 1997; Van Muiswinkel et al., 1998; Петрова, Отеллин, 2000; Сабурина и др., 2002). Модель трансплантации эмбриональных закладок ЦНС в периферический нерв позволяет проследить гистогенетичес-кие процессы после повреждения тканей донора и реципиента, в условиях измененного микроокружения, в отсутствие специфической афферентной и эфферентной иннервации. Цель настоящего исследования - установление особенностей развития НАДФ-д-содержащих нейронов спинного мозга в условиях гетеротопической нейротран-сплантации.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работа выполнена на 10 самках и 30 самцах крыс линии Вистар. Срок развития эмбрионов определяли по методу, описанному Дыбаном
11S
и др. (1975). Исходным материалом для трансплантации служили фрагменты шейного отдела спинного мозга эмбрионов 15 сут развития. Пересадка эмбрионального материала в седалищный нерв взрослых крыс осуществлялась под эфирным наркозом по описанной ранее методике (Чу-масов, Петрова, 1990). Животных содержали в обычных условиях вивария и умерщвляли парами этилового эфира через 5, 7, 15, 60 сут и 6 мес после операции. Для сравнения выделяли фрагменты шейного отдела спинного мозга крыс с 15-е по 21-е сут пренатального развития, а также у новорожденных, 2-месячных и 9-месячных крыс. Материал фиксировали в течение 2.5 ч в 4%-ном растворе параформальдегида ("Fluka", Швейцария) на фосфатном буфере (рН 7.2) и промывали в 20%-ном растворе сахарозы в течение 24 ч. Для выявления NOS использовали гистохимическую реакцию на НАДФ-д. Срезы толщиной 30-50 мкм изготавливали на замораживающем микротоме и окрашивали в течение 30 мин при 37°С в растворе (рН 7.2), содержащем 1 мг/мл Р-НАДФ ("Sigma", США ), 0.3 мг/мл нитросинего тетразолия ("Sigma", США) и 0.3% Тритона Х-100. Затем обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заключали в канадский бальзам. В качестве контроля использовали окрашивающий раствор без добавления Р-НАДФ. Через 2 и 6 мес после операции определяли число НАДФ-д-позитивных нейронов на единицу площади трансплантата. Площади трансплантатов измеряли с помощью полуавтоматического анализатора изображения М0Р-30 (Австрия). Для статистической обработки использовали ¿-критерий Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что до 17 сут пренатального развития НАДФ-д-положительную реакцию проявляют лишь эндотелиоциты многочисленных капилляров, врастающих в спинной мозг из оболочек. На 17-е сут эмбрионального развития вблизи центрального канала можно видеть отдельные мелкие КО-ергические нейроны. Их число увеличивается на 18-е сут пренатального развития (рис. 1, а). Как правило, это биполярные и униполярные НАДФ-д-позитивные нервные клетки размером до 18 х 10 мкм с длинными отростками. Некоторые из них располагаются вблизи капилляров. На 20-е сут эмбрионального развития число НАДФ-д-позитивных нейронов вокруг центрального канала и интенсивность их окрашивания увеличиваются. Отдельные НАДФ-д-позитивные нейроны видны в области презумп-тивных дорсальных рогов спинного мозга; их число возрастает у новорожденных крыс (рис. 1, б). У 2-месячных крыс в шейном отделе спинного мозга НАДФ-д-позитивные клетки (размером до 8 х 25 мкм) располагаются в области центрально-
Ч
\ ¿4 . " J . > -
1 - /
h >Г ' к
/ •х ■ ' ' * -
. • ' ^ ■ / .
к к
а ,_,
1 \ ' , ' , А 1
0
б j I 1
il 1
Рис. 1. НАДФ-д-позитивные развивающиеся нейроны в спинном мозгу крысы и в трансплантате в нерв. а - биполярные нейроны в шейном отделе спинного
мозга крысы, 18-е сут пренатального развития (-»-);
б - нейроны в спинном мозгу новорожденных крыс; в - униполярный нейрон в трансплантате через 7 сут после пересадки. Гистохимическая окраска на НАДФ-д. Масштаб: а, б - 50; в - 20 мкм. В - вентри-кулярная зона, К - капилляры.
го канала; большое число мелких отросчатых нейронов (3-8 х 10 мкм) можно видеть в области дорсальных рогов; крупные мотонейроны в области передних рогов спинного мозга достигают размеров 37 х 50 мкм. Они менее интенсивно ок-
рашены, чем мелкие нейроны дорсальных рогов, в их отростках НАДФ-д выявляется главным образом в основаниях. 9-Месячные крысы имеют сходную топографию НАДФ-д-позитивных нейронов. По данным Лэя с соавторами (Lai et al., 1994), число NO-ергических нейронов в мозгу млекопитающих не изменяется с возрастом и сходно у 6, 15 и 28-месячных крыс.
Во все изученные сроки после трансплантации на продольных срезах через седалищные нервы крыс-реципиентов в 70-80% случаев присутствуют нейротрансплантаты разных размеров и формы. На НАДФ-д в нервных стволах окрашиваются эндотелиальные и гладкомышечные клетки кровеносных сосудов. В эндотелии кровеносных сосудов синтезируется эндотелиальная NOS (Huang, Lo, 1998), а в гладкомышечных клетках NOS синтезируется под влиянием цитокинов, в частности интерлейкина-1 (Geng et al., 1994). Последний присутствует в нервных стволах при повреждении (Lindholm et al., 1987).
В трансплантатах эмбрионального спинного мозга, располагающихся в нервных стволах, отдельные мелкие и неравномерно окрашенные НАДФ-д-позитивные нейроны выявляются лишь через 7 сут после пересадки (рис. 1, в). Их размеры достигают 5 х 9 мкм, как правило, они имеют би- или униполярную форму. По сравнению со спинным мозгом соответствующего срока развития in situ (новорожденные крысы) число таких клеток незначительно, размеры и интенсивность окраски снижены, отростки выявляются слабо. Через 15 сут после пересадки количество и размеры НАДФ-д-позитивных клеток увеличиваются. Некоторые клетки достигают размеров 12 х х 40 мкм. Через 60 сут в трансплантатах обнаруживают реакцию на НАДФ-д большее число нейронов, чем в предыдущие сроки (рис. 2, а, •). По интенсивности окраски и размерам они сходны с нейронами спинного мозга взрослых крыс. В трансплантатах можно видеть НАДФ-д-пози-тивные мотонейроны разнообразной формы, располагающиеся в нейропиле одиночно и имеющие большое число ветвящихся отростков. Наиболее крупные нервные клетки достигают размеров 40 х 50 мкм. Небольшие НАДФ-д-позитивные нейроны образуют скопления, сходные с ядрами спинного мозга. Нередко НАДФ-д-позитивные нейроны располагаются вблизи кровеносных сосудов или достигают их своими отростками.
Через 6 мес после пересадки трансплантаты сохраняют жизнеспособность. Нейроны, синтезирующие НАДФ-д, морфологически сходны с нервными клетками трансплантатов предыдущего срока фиксации (рис. 2, в, г). Подсчет числа НАДФ-д-позитивных нейронов на единицу площади показал, что их количество достоверно не изменяется по сравнению с 2-месячными транс-
плантатами: через 2 мес - 21.26 ± 5.25, через 6 -18.48 ± 2.39 клеток (р > 0.05).
Итак, в настоящем исследовании установлено, что в условиях гетеротопической транспла
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.