научная статья по теме НАДМОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ФИБРИЛЛ HFQ-ПОДОБНЫХ БЕЛКОВ Химия

Текст научной статьи на тему «НАДМОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ФИБРИЛЛ HFQ-ПОДОБНЫХ БЕЛКОВ»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 4, с. 517 - 526

УДК 577.1

НАДМОЛЕКУЛЯРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ФИБРИЛЛ Hfq-ПОДОБИЫХ БЕЛКОВ*

© 2015 В.Н. Мурина1**, О.М. Селиванова1, А.О. Михайлина1, А.С. Казаков2, Е.Ю. Никонова1, Н.В. Леконцева1, С.В. Тищенко1, А.Д. Никулин1

1 Институт белка РАН, 142290 Пущино Московской обл.;

электронная почта: thyrada@rambler.ru

2 Институт биологического приборостроения РАН, 142290

Пущино Московской обл.

Поступила в редакцию 28.10.14

Бактериальные белки семейства Hfq являются структурными гомологами архейных и эукариотических Sm/Lsm белков с характерной структурой из пяти-тяжевого Р-листа и одной ^-концевой а-спирали. Ранее было показано, что архейные Lsm белки (SmAP) способны спонтанно образовывать протяженные фибриллы, в то время как белок Hfq из Escherichia coli может их формировать только при определенных условиях. Архитектура этих фибрилл значительно различается, и причина таких различий в упаковке не была найдена. В данной работе исследованы фибриллы, образуемые белком Hfq из Pseudomonas aeruginosa и белком SmAP из археи Methanococcus jannaschii, имеющими высокую гомологию с белком Hfq из E. coli. Обнаружено, что белок Hfq из P. aeruginosa образует фибриллы только при заменах в консервативном аминокислотном мотиве Sm2, а белок SmAP из M. jannaschii способен их формировать спонтанно. Несмотря на то, что условия образования фибрилл исследованными белками различаются, упаковка гексамеров оказалась аналогичной той, что была предложена для фибрилл Hfq из E. coli. Это позволяет предполагать универсальный характер архитектуры фибрилл, образуемых белками Hfq.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Sm-подобные белки, Hfq, четвертичная структура белков, фибриллы.

Белок Шд — это посттрансляционный регулятор экспрессии генов, который, связывая малые регуляторные некодирующие РНК, способствует их взаимодействию с матричными РНК [1, 2]. Он принадлежит обширному семейству ^ш/Ьвш (8ш-Нке) белков, представители которого найдены в бактериях, археях и эукариотах [3]. Эукариотические 8ш и Ьвш белки — важные компоненты рибонуклеопротеидных комплексов, которые участвуют в процессинге РНК, включая сплайсинг, деградацию мРНК, образование гистонов, репликацию теломераз [4—5]. Функция архейных Ьвш белков до настоящего времени исследована очень слабо [6], однако известно, что они могут связывать малые РНК архей [7].

Белки семейства 8ш/Ьзш имеют характерную консервативную третичную структуру из ^-кон-цевой а-спирали, пяти р-тяжей (8ш домен) и неупорядоченного С-концевого участка вариабельной длины [8] (рис. 1). Контактируя внеш-

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-297, 15.02.2015.

** Адресат для корреспонденции.

ними тяжами в 4 и р5, принадлежащими домену 8ш, белки формируют тороидальную четвертичную структуру, состоящую из шести (бактериальные белки Шд) или семи (архейные 8шАР, эукариотические 8ш и Ьвш белки) мономеров. Такая характерная организация четвертичной структуры Ьвш белков нужна, по всей видимости, для специфического связывания небольшим по размеру белком повторяющихся участков од-нонитевой РНК [9—10]. 8ш домен включает в себя два консервативных аминокислотных мотива 8ш1 (тяжи р1, р2 и р3) и 8ш2 (тяжи р4 и Р5), соединенных петлей Ь4, имеющей длину всего 4 аминокислотных остатков у бактериальных белков Шд, и ~20 остатков у Ь8ш белков архей и эукариот [8]. Считается, что петля Ь4 не оказывает влияние на четвертичную структуру белка [11]. Последовательности 8ш1 и 8ш2 мотивов консервативны среди всех белков [11—12], однако в бактериях 8ш2 мотив имеет строго консервативный консенсус из аминокислотных остатков УКНА, в то время как эукариотические и архейные Ьвш белки характеризуются паттерном ЯОхх [10—11]. Предполагалось, что это различие в первичной структуре 8ш2 мотива может

влиять на число субъединиц белка в формируемых частицах белков, а гистидин His57 консенсуса УКНА, образующий межсубъединичные водородные связи, может играть важную роль в стабилизации гексамера белка Hfq [13]. Однако оказалось, что замена His57 на аланин, треонин или аспарагин хоть и приводит к значительному понижению термостабильности белка, но не меняет его пространственную организацию [14]. Позже было показано, что замена остатка Tyr55 на аланин также не оказывает влияния на структуру белка [15]. Таким образом, единичная замена в консенсусе YKHA не способна привести к изменению четвертичной структуры белка. Однако скажется ли замена всех четырех аминокислотных остатков консенсуса YKHA на структурные свойства белка? Для ответа на этот воп-

рос мы провели замену бактериального консенсуса в белке Hfq из Pseudomonas aeruginosa (Pae Hfq) на последовательность RGDT, которую имеет гептамерный архейный белок SmAP1 из Archaeoglobus fulgidus.

Известно, что архейные белки SmAP из Pyrobaculum aerophilum и Methanobacterium ther-mautotrophicum могут спонтанно формировать в растворе полярные фибриллы неамилоидного типа [16]. Диаметр фибрилл (~8 нМ) соизмерим с размером отдельно взятого гептамера SmAP1, что позволило предложить модель упаковки белка, при которой гептамеры располагаются «голова к хвосту» перпендикулярно оси фибриллы. Эти фибриллы в свою очередь способны полимеризоваться в толстые (~50 нм) пучки из нескольких параллельно уложенных фибрилл.

Рис. 1. Сравнение первичной структуры представителей бактериальных белков Шя и архейных SmAP белков. Обозначены элементы вторичной структуры, консервативные мотивы Sm1 (тяжи р1, р2 и р3) и Sm2 (тяжи р4 и р5), петля Ь4. Пунктирным прямоугольником выделен консервативный в Шд консенсус УКНА мотива Sm2

Позже было показано, что белок Hfq E. coli также может образовывать фибриллы, однако только после диализа в раствор с додецил^-Б-маль-тозидом и лиофилизации с последующим ресус-пендированием белка в воде [17]. С помощью электронной микроскопии и фурье-ИК-спект-роскопии было показано, что белок формирует цилиндрические спирально-закрученные фибриллы, организованные из шести гексамеров белка, располагающихся тонким слоем по поверхности цилиндра. Диаметр такого цилиндра составил 17 нм, а угол между плоскостью гекса-мера и осью фибриллы — 37,7° (расчетные данные получены, исходя из шага спирали в 24 нм и расстояния между плоскостями гомогексамеров Hfq — 4 нм) [17]. Таким образом, как архейные SmAP белки, так и бактериальные белки Hfq, могут формировать фибриллы, однако структурная организация и условия их образования значительно различаются. Мы исследовали влияние произведенной замены YKHA/RGDT на способность белка Pae Hfq к образованию фибрилл и сравнили полученные результаты с данными, полученными для белка SmAP из археи Methanococcus jannaschii (Mja SmAP), который имеет характерные признаки бактериальных белков Hfq: имеет бактериальный консенсус YKHA Sm2 мотива, а петля L4 между Sm1 и Sm2 мотивами отсутствует [18].

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клонирование гена белка Pae Hfq YKHA/RGDT и выделение белка. Для получения замены YKHA/RGDT в белке Pae Hfq был использован QuikChange Site_Directed Mutagenesis Kit («Stra-tagene», США). ПЦР проводили с использованием плазмиды pET22b(+)/Hfq и олигонуклео-тидных праймеров:

5'-GTCAGCCAGATGGTTCGCGGCGACAC-GATCTCCACCG-3' (прямой) и

5'-CGGTGGAGATCGTGTCGCCGCGAAC-CATCTGGCTGAC-3' (обратный),

содержащих необходимые замены. Полученную конструкцию проверяли секвенированием. Экспрессию гена и очистку белка Pae Hfq дикого типа проводили, как описано ранее [14]. Для экспрессии гена белка Pae Hfq YKHA/RGDT использовали клетки E. coli штамма BL21(DE3). Клетки наращивали в среде LB при 42° до оптической плотности OD600 ~ 0,8 ОЕ. Индукцию проводили добавлением ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ в течение 2 ч. Клетки осаждали центрифу-

гированием и разрушали ультразвуком в буфере 1 М NaCl, 0,25 М MgCl2 и 5 мМ EDTA, 50 мМ Tris-HCl, рН 8,0. Клеточные стенки и рибосомы осаждали последовательным центрифугированием в течение 20 мин при 14 000 g и 50 мин при 90 000 g соответственно. Надосадочную жидкость диализовали в буфер 0,1 M NaCl, 50 мМ Tris-HCl, рН 8,0, наносили на колонку с Heparin-Sepharose («Amersham», Швеция) и смывали в градиенте 0,1-0,8 M NaCl с 50 мМ Tris-HCl, рН 8,0. Фракции анализировали с помощью электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии ДСН. Белок Pae Hfq YKHA/RGDT был сконцентрирован до 12 мг/мл в растворе с 0,3 M NaCl и 50 мМ Tris-HCl, рН8,0.

Клонирование гена белка SmAP из M. jannaschii и выделение белка. Ген белка SmAP из M. jannaschii был клонирован в экспрессионный вектор pET11a-PL. Матрицей для ПЦР была геномная ДНК M. jannaschii. Для ПЦР использовали праймеры:

5'-GGAATTCCATATGAATAAGCCAGTAAAA-AAACAGCAACCAAAGAAAGTC-3' (прямой) и

5'-CAATATGAATTCTTAGTATTCTATGTAGT-CAATAGCATGTTTAAATACTAATAAGTTCC-3' (обратный),

имеющие сайты для эндонуклеаз рестрикции FauNDl и EcoRl соответственно. Нуклеотидная последовательность клонированного гена была проверена секвенированием.

Ген белка Mja SmAP был экспрессирован в штамме-суперпродуценте E. coli BL21(DE3). Во избежание ошибочного включения аминокислот в архейный белок (лизина вместо аргинина) клетки были котрансформированы плазмидой pUBS520 [19]. Эта плазмида несет ген аргинино-вой тРНК (тРНКдЛа/аоо), узнающей редкие для E. coli кодоны аргинина AGA и AGG [20], а также ген kan, обуславливающий устойчивость к канамицину.

Клеточную культуру растили при 37° на среде LB, содержащей 100 мкг ампицилина и 50 мкг канамицина на 1 мл среды, до оптической плотности OD600 ~ 0,8 ОЕ. Для активации Т7 РНК-полимеразы в среду добавляли ИПТГ до конечной концентрации 0,6 мМ. После добавления индуктора клетки инкубировали при 20° в течение ночи. Клетки собирали центрифугированием (8000 g, 20 мин, 4°). Биомассу ресуспендиро-вали в лизирующем буфере (50 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 1 М NaCl, 0,25 М MgCl2 и 5 мМ EDTA) и разрушали на проточном прессе EmulsiFlex-C3 («Avestin», Канада). Клеточный дебрис осажда-

ли центрифугированием 30 мин при 14 000 g. Супернатант прогревали при 82° 20 мин. Денатурировавшие термолабильные белки E. coli осаждали низкоскорос

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком