УДК 57.03;57.017.64
НАКОПЛЕНИЕ ДЕЛЕЦИЙ В ДНК МИТОХОНДРИЙ ГИППОКАМПА ПРЕЖДЕВРЕМЕННО СТАРЕЮЩИХ КРЫС OXYS И ВЛИЯНИЕ НА НЕГО АНТИОКСИДАНТА SkQ1
© 2015 П.С. Лощенова1, О.И. Синицына12, Л.А. Федосеева1, Н.А. Стефанова1, Н.Г. Колосова1,2,3*
1 Институт цитологии и генетики СО РАН, 630090 Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 10; электронная почта: kolosova@bionet.nsc.ru
2 Новосибирский государственный университет, 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 2 3 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ Митоинженерии, 119991 Москва
Поступила в редакцию 16.12.14 После доработки 09.01.15
Снижение эффективности окислительного фосфорилирования при старении и развитии ассоциированных с ним нейродегенеративных заболеваний, в т.ч. болезни Альцгеймера, связывают с накоплением протяженных делеций митохондриальной ДНК (АмтДНК), которые рассматривают как маркер окислительных повреждений. Недавно мы показали, что адресованный в митохондрии антиоксидант 8кр1 (10-(6'-пластохино-нил)децилтрифенилфосфоний) способен замедлять развитие признаков болезни Альцгеймера у преждевременно стареющих крыс ОХУ8. Цель настоящей работы — исследование связи развития нейродегенеративных изменений в мозге крыс ОХУ8 с изменением количества мтДНК и протяженной делеции мтДНК 4834 п.н. (АмтДНК4834) и влияния на них 8кр1. Исследовали относительное количество мтДНК и АмтДНК4834 в гип-покампе крыс ОХУ8 и Вистар (контроль) в возрасте 1, 2, 6, 10, 20 дней и 3, 6 и 24 мес. В период, критический для манифестации признаков преждевременного старения крыс ОХУ8 (с 1,5 до 3 мес.), оценивали влияние приема 8кр1 (250 нмоль/кг) и витамина Е (670 ммоль/кг — препарат сравнения) на количество мтДНК и АмтДНКда4, а также на формирование у крыс ОХУ8 поведенческого признака ускоренного старения — пассивного типа поведения в тесте «открытое поле». У крыс ОХУ8 уровень АмтДНКда4 в гиппокампе повышен, по сравнению с крысами Вистар, наиболее существенно — в период завершения формирования мозга в постнатальный период и остается повышенным как на стадиях, предшествующих манифестации проявлений ускоренного старения мозга и развития признаков болезни Альцгеймера, так и в период их прогрессии, но в возрасте 24 мес. различий не выявлено. Прием 8кр1 снизил уровень АмтДНКда4 в гиппокампе крыс Вистар и ОХУ8 и замедлил формирование пассивного поведения у крыс ОХУ8. Полученные результаты подтверждают перспективность использования 8кр1 для профилактики старения мозга.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: старение, гиппокамп, митохондрии, делеция 4834 пар оснований митохондриальной ДНК, адресованный в митохондрии антиоксидант 8кр1.
Старение человека и животных связано с постепенным снижением когнитивных функций (прежде всего способности к обучению и памяти), ростом риска развития нейродегенеративных заболеваний [1]. Важную роль в их развитии играют мутации митохондриальной ДНК
Принятые сокращения: 8кр1 — антиоксидант 10-(6-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний, мтДНК — мито-хондриальная ДНК, п.н. — пары нуклеотидов, АмтДНК — делеция мтДНК, АмтДНК4834 — делеция 4834 п.н. мтДНК, АФК — активные формы кислорода.
* Адресат для корреспонденции.
(мтДНК) и связанная с ними дисфункция митохондрий [2]. С возрастом доля мтДНК с протяженными делециями растет. Их накопление наиболее существенно в тканях с высоким уровнем энергетического метаболизма — мышцах и мозге, где уровень делеций существенно зависит от региона [3]. Накопление делеций мтДНК рассматривается как одна из причин снижения эффективности окислительного фосфорилиро-вания при старении и развитии связанных с ним нейродегенеративных заболеваний, в т.ч. болезней Паркинсона [4] и Альцгеймера [5]. В свою очередь снижение эффективности работы дыха-
тельной цепи приводит к усиленному накоплению окислительных повреждений мтДНК и де-леций в результате окислительного стресса — нарушения баланса в системах генерации и деток-сикации активных форм кислорода (АФК). Закономерно, что для профилактики возрастных изменений активно используются антиоксидан-ты. Однако убедительных доказательств того, что они способны обеспечить защиту от нейро-дегенеративных изменений, сопровождающих ассоциированные со старением когнитивные расстройства, и тем более профилактику нейро-дегенеративных заболеваний, на сегодня нет. Недавно было показано, что уникальным ней-ропротекторным потенциалом обладает адресованный в митохондрии антиоксидант SkQ1 [6—8]. В наномолярных концентрациях он не только предотвратил, но и снизил выраженность ряда признаков ускоренного старения у крыс OXYS — созданной в Институте цитологии и генетики СО РАН модели преждевременного старения и ассоциированных с ним заболеваний [6, 9—16]. Развитие нейродегенеративных изменений у крыс OXYS связано с изменениями метаболического пути болезни Альцгеймера: усиленным накоплением в коре головного мозга и гиппокампе белка-предшественника амилоида бета и растворимого амилоида в (1—42), образованием амилоидных бляшек и гиперфосфори-лированием тау-белка — ключевых маркеров заболевания [7, 17]. Гиперфосфорилирование тау-белка у крыс OXYS регистрируется уже в возрасте 3 мес. К этому возрасту у них формируется пассивный тип поведения, повышается тревожность, нарушаются способность к обучению и память, формирование длительной посттетани-ческой потенциации, методами МРТ выявляются нейродегенеративные изменения в мозге [7, 17]. Примечательно, что манифестация всех этих признаков опережает по времени повышенное накопление в гомогенатах мозга маркеров окислительного стресса — окисленных белков и липидов [18]. Недавно мы показали, что профилактический прием SkQ1 существенно замедляет ускоренное старение мозга крыс OXYS и снижает содержание в нем ключевых маркеров болезни Альцгеймера [7], однако механизм его нейропротекторного действия остается неясным.
Как полагают Майсснер с соавт., идеальным критерием оценки темпов старения человека и, соответственно, эффективности воздействия на них может служить накопление делеции мтДНК 4977 п.н. [19], прежде всего — в клетках постми-тотических тканей, характеризующихся высоким энергетическим потреблением — мышечной и нервной [20, 21]. При моделировании бо-
лезни Альцгеймера введением амилоида бета в гиппокампе крыс было зарегистрировано увеличение количества ЛмтДНК4834 [22] — делеции, которая соответствует делеции 4977 п.н. мтДНК у человека и возникает в результате рекомбинации между двумя 16-нуклеотидными повторами (позиции 8,103-8,118 и 12,937-12,952), приводя к элиминации ряда генов: т1-пй5, тХ-Т1, т^Тя, т^ТН, mt-nd4, mt-nd4l, т^Тг, т^пйЗ, mt-Tg, т^ соЗ, mt-Atp6 [20, 23]. Целью настоящей работы явилось исследование связи развития нейроде-генеративных изменений в мозге крыс ОХУ8 с изменением количества мтДНК и ЛмтДНК4834, а также влияния 8кр1 на эти показатели. Для этого определяли относительное количество ЛмтДНК4834 и мтДНК в гиппокампе крыс ОХУ8 и Вистар (контроль) разного возраста, а также исследовали влияние на эти показатели приема 8кр1 в период, критический для манифестации признаков преждевременного старения крыс ОХУ8 — в возрасте с 1,5 до 3 мес. В качестве препарата сравнения использовали витамин Е. Влияние антиоксидантов на накопление ЛмтДНК4834 сопоставляли с их способностью предупреждать формирование у крыс ОХУ8 поведенческого признака ускоренного старения их мозга — пассивного типа поведения в тесте «открытое поле».
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные и воздействие на них. Работа выполнена на самцах крыс ОХУ8 и Вистар на базе Центра коллективного пользования «Генофонды лабораторных животных» Института цитологии и генетики СО РАН в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием лабораторных животных». Крыс содержали группами по пять особей в клетках размером 57 х 36 х 20 см при температуре 22 ± 2° в условиях фиксированного режима освещения (12 ч свет/12 ч темнота) при свободном доступе к воде и пище — стандартному гранулированному корму для лабораторных животных («Чара», ЗАО «Ассортимент-Агро», Россия).
Для исследования изменения содержания ЛмтДНК4834 и мтДНК в гиппокампе крыс ОХУ8 и Вистар с возрастом использовали животных в возрасте 1, 2, 6, 10, 20 дней и 3, 6 и 24 мес. (по 5 животных в группе). При оценке влияния на эти показатели антиоксидантов животные опытных групп получали с 1,5 до 3 мес. с кормом 8кр1 (синтезирован в НИИ митоинженерии МГУ) или витамин Е (токоферола ацетат производства «Уралбиофарм», Россия) в дозе 250 нмоль и 670 ммоль на кг массы тела соответственно.
Крысы контрольной группы получали только корм. Количество животных в группах — 15.
Исследование влияния препаратов на поведение животных в тесте «открытое поле» проводили в возрасте 3 мес., используя квадратную камеру (100 х 100 см) с пластмассовыми стенками высотой 40 см. Освещение обеспечивалось бестеневой лампой мощностью 100 Вт, расположенной на высоте 100 см над центром поля. Животное помещали в угол камеры, после чего регистрировали его двигательную активность в течение 5 мин. Подсчитывали количество пересеченных квадратов, вертикальных стоек.
Выделение тотальной ДНК из гиппокампа. Тотальную (митохондриальную и ядерную) ДНК из гиппокампа выделяли, используя набор WizardR Plus SV Genomic DNA Purification System («Promega», США) в соответствии с протоколом производителя.
ПЦР в режиме реального времени. Относительное количество мтДНК и относительное количество АмтДНК4834 определяли методом ПЦР в реальном времени с использованием зондов TaqMan. Для определения мтДНК непосредственно в тотальной ДНК был использован метод, описанный Никлас с соавт. [24]. Количество мтДНК (при помощи амплификации района D-петли) измеряли относительно количества ядерной ДНК, определяемого по уровню содержания ДНК гена 18S рРНК. Количество АмтДНК4834 (амплификация участка, образующегося в результате смыкания последовательностей, фланкирующих делетируемый участок мтДНК) измеряли относительно количества мтДНК. Последовательности праймеров и зондов, подобранные с использованием онлайн-олигоанализатора Integrated DNA Technologies (http://eu.idtdna.com/PrimerQuest/), приведены
в таблице. Олигонуклеотиды синт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.