МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 3, с. 311-315
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.222.3
НАКОПЛЕНИЕ ПОЛИ-р-ОКСИМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ ДИССОЦИАНТАМИ ЯИОВОВЛСТЕЯ ЗРИЛЕЯОЮЕЗ
© 2015 г. Е. Н. Красильникова, Е. С. Милько, О. И. Кеппен, Н. В. Лебедева, Р. Н. Ивановский
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра микробиологии Поступила в редакцию 19.09.2014 г.
При росте на среде с ацетатом в качестве запасного продукта Я- и М-диссоцианты пурпурной фо-тосинтезирующей бактерии Rhodobactersphaeroides 2Я накапливают поли-Р-оксимасляную кислоту (ПБМК). Накопление этого полимера происходит как при росте в анаэробных условиях на свету, так и в аэробных условиях в темноте. В условиях роста на среде, несбалансированной по углероду и азоту (С/К = 4) содержание ПБМК в стационарной фазе роста в аэробных темновых условиях у Я-диссоцианта достигало 40% от веса сухих клеток и 70% у М-диссоцианта. Это делает М-диссоциант Rba. sphaeroides перспективной культурой для получения ПБМК в условиях крупнотоннажного промышленного производства. При исследовании активности ферментов цикла трикарбоновых кислот показано, что основной причиной увеличения синтеза ПБМК у Rba. sphaeroides является снижение активности цитратсинтазы — ключевого фермента включения ацетата в систему реакций цикла трикарбоновых кислот. В дополнение к этому у М-диссоцианта Rba. sphaeroides, выросшего в аэробных условиях в темноте, значительно снижается активность НАДН-оксидазы, участвующей а окислении восстановленного НАДН, генерируемого в ЦТК при окислении ацетата. В сумме эти два фактора увеличивают возможность ассимиляции ацетата через альтернативный механизм синтеза ПБМК.
Ключевые слова: фотосинтезирующие бактерии, Rhodobacter sphaeroides, поли-Р-оксимасляная кислота, R- и M-диссоцианты.
DOI: 10.7868/S0026365615030118
Полигидроксиалканоаты (ПГА) — полимеры гидроксипроизводных алкановых кислот, которые синтезируются микроорганизмами в качестве запасного вещества. Этот полимер вырабатывается многими хемотрофными, фототрофными и хемо-литотрофными микроорганизмами [1—3]. ПГА обладают широким спектром ценных свойств, включая биоразрушаемость и биосовместимость. Эти свойства делают их перспективными для различных сфер применения, включая производство упаковочных материалов, медицину и фармакологию. До недавнего времени высокая стоимость ПГА не позволяла применять их достаточно широко, и экономически обоснованными были только специальные сферы - медицина и фармакология. В этой области они применяются в качестве матрицы для тканевой инженерии, получения хирургических и нетканых материалов, элементов для остеосинтеза, сосудистых протезов и систем доставки лекарственных веществ [4]. Rhodobacter sphaeroides в качестве запасного веще-
1 Автор для корреспонденции: (e-mail: mguru@mail.ru).
ства накапливает ПГА (поли-Р-оксимасляную кислоту, ПБМК). Наибольшее количество этого полимера образуется в стационарной фазе роста бактерий на среде несбалансированной по углероду и азоту. Максимальный синтез ПБМК, как правило, наблюдается при содержании в среде избытка углерода (Сгр/Кгр > 1) [5—8]. Ранее было установлено, что Rba. sphaeroides штамм 2Я может расщепляться на Я- и М-диссоцианты [9, 10]. При росте бактерий в анаэробных условиях на свету преобладает преимущественно Я-вариант, тогда как аэробные темновые условия благоприятны для роста М-варианта. Я- и М-диссоцианты различаются по ряду морфологических, физиологических, биохимических свойств, активности ряда ферментов цикла трикарбоновых кислот [10]. Одним из способов оптимизации синтеза ПГА у микроорганизмов является ранее не используемое получение диссоциантов, обладающих повышенной способность к синтезу ПБМК.
В данной работе исследовались образование ПБМК и некоторые особенности метаболизма ацетата у диссоциантов Rba. sphaeroides штамм 2Я
311
4*
Таблица 1. Рост и образование ПБМК Я- и М-диссоциантами ЯЬа. 8ркаего1ёв8, выросшими в анаэробных условиях на свету на среде с сбалансированным (С/К = 1) и несбалансированным (С/К = 4) содержанием углерода и азота (нмол мин-1 мг белка-1)
ПБМК/белок C/N = 1 C/N = 4
R М R М
ПБМК (мкг в мл) 68.0 17.2 83.2 174.7
ПБМК (мкг/мг белка) 0.486 0.114 0.438 1.028
ПБМК (% от сухих клеток) 29.2 7.4 42.8 69.5
Белок (мкг/мл) 140.0 150.0 190.0 170.0
при росте бактерий на сбалансированной и несбалансированной по углероду и азоту среде.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования являлась пурпурная фо-тосинтезирующая бактерия ВкойоЬа^ег sphaeroides 2Я. Культуру выращивали на среде Ормерода с 0.1% ацетата и 0.1% (соотношение С/К = 1) сульфата аммония или 0.2% ацетата и 0.05% сульфата аммония (соотношение С/К = 4) в анаэробных условиях на свету во флаконах, доверху залитых средой, и в темноте на качалке (200 об. в мин.) в колбах объемом 750 мл с 250 мл среды. Рост бактерий происходил в течение 2-4 сут. Содержание поли-Р-оксимасляной кислоты (ПБМК) определяли в стационарной фазе роста бактерий. 2-4 мл клеточной суспензии центрифугировали и промывали 2 раза дистиллированной водой. К осадку клеток добавляли 1 мл дистиллированной воды и 9 мл смеси ацетон/метанол (7/2), клетки растирали и оставляли на 10-20 мин для экстракции пигментов. Эту процедуру повторяли несколько раз до полного обесцвечивания клеток бактерий. К осадку добавляли абсолютный этанол и выдерживали 20 мин при 50°С для удаления остатка воды. Затем к осадку приливали 10 мл хлороформа и оставляли на ночь при 30°С для извлечения ПБМК. Полученную суспензию фильтровали через стеклянный фильтр. Фильтрат упаривали досуха, после чего прибавляли 10-50 мл концентрированной серной кислоты и нагревали 10 мин на кипящей водяной бане. Полученную вследствие гидролиза ПБМК кротоновую кислоту измеряли при 235 нм (молярная экстинкция Е235 = 1.55 х 104 см-1 М-1) [12]. Для получения сухой биомассы отмытые дистиллированной водой суспензии сырых клеток помещали в бюксы, доведенные до постоянного веса, и высушивали при 105°С.
Для определения ферментов цикла трикарбо-новых кислот (ЦТК) использовали культуру в экспоненциальной фазе роста. Клетки отмывали от среды трис-НС\ буфером рН 7.8 и разрушали в том же буфере с помощью ультразвука при 22 кГц в течение 3 мин. Неразрушенные клетки и круп-
ные фрагменты клеток осаждали центрифугированием (36000 g, 20 мин, 4°С), а полученный су-пернатант использовали для энзиматических исследований. Измерение активности ферментов проводили при комнатной температуре по ранее указанным методам [11]. Все измерения проводили на спектрофотометре фирмы Hitachi 200-20.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Рост и образование ПБМК. При росте Rba. sphaeroides в анаэробных условиях на свету накопление белка в стационарной фазе роста у R- и М-диссоциантов на среде с дефицитом источника азота (C/N = 4) выше, чем на сбалансированной (C/N = 1) по азоту и углероду среде (табл. 1). При этом у R-диссоцианта этот показатель выше (135%), чем у M-варианта (115%). Содержание ПБМК на несбалансированной среде у обоих диссоциантов также увеличивался. При этом накопление ПБМК (в % от сухих клеток) на несбалансированной среде у М-диссоцианта увеличивалось примерно в десять раз (939%), в то время как у R-дис-социанта это увеличение выражено в меньшей степени (146.5%).
В темноте в аэробных условиях на несбалансированной среде R и М (табл. 2) оба диссоцианта растут заметно хуже, чем на сбалансированной по азоту и углероду среде (71.8 и 31.5% соответственно). Накопление ПБМК (в % от сухих клеток) на несбалансированной среде у R- и М-диссоциантов значительно увеличилось (650.1 и 337.1% соответственно).
Таким образом, перспективным для использования в качестве продуцента ПБМК является М-диссоциант, выращиваемый в анаэробных условиях на свету. В этих условиях в стационарной фазе роста он накапливал сопоставимое с R-диссо-циантом количество биомассы (170 мкг/мл белка M-диссоциант и 190 мкг/мл белка R-диссоци-ант), но накапливал существенно больше ПБМК (69.5% от сухих клеток M-диссоциант и 48.2% от сухих клеток R-диссоциант). Однако в условиях крупнотоннажного производства более перспективным может оказаться получение ПБМК при
НАКОПЛЕНИЕ ПОЛИ-Р-ОКСИМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ
313
Таблица 2. Рост и образование ПБМК Я- и М-диссоциантами ЯЬа. 8ркаего1ёв8, выросшими в аэробных условиях в темноте на среде с сбалансированным (С/К = 1) и несбалансированным (С/К = 4) содержанием углерода и азота (нмол мин-1 мг белка-1)
ПБМК/белок С/К = 1 С/К = 4
Я М Я М
ПБМК (мкг в мл) 228.2 50.6 180.2 228.2
ПБМК (мкг/мг белка) 0.106 0.433 2.145 4.386
ПБМК (% от сухих клеток) 7.1 17.8 46.2 60.0
Белок (мкг/мл) 117.0 165.0 84.0 52.0
Таблица 3. Активность ферментов ЦТК в экстрактах клеток Я- и М-диссоциантов Яда. 8ркаего1ёе8, выросших на свету в анаэробных условиях на среде с сбалансированным (С/К = 1) и несбалансированным (С/К = 4) содержанием углерода и азота (нмол мин-1 мг белка-1)
Фермент С/К = 1 С/К = 4
Я М Я М
Цитратсинтаза 114.4 111.1 47.5 75.0
Аконитаза 43.2 148.8 43.3 170.2
Изоцитратдегидрогеназа 6.1 83.6 89.5 109.5
2-Оксоглутаратдегидрогеназа 2.8 0.6 2.0 3.1
Сукцинатдегидрогеназа 9.4 6.6 29.0 14.4
Фумараза 14.5 25.2 64.4 80.9
Малатдегидрогеназа 61.7 408.4 314.2 319.1
Малатсинтаза 12.6 21.0 29.3 24.7
выращивании М-диссоцианта ЯЬа. sphaeroides в аэробных условиях в темноте, поскольку стоимость фотобиореакторов и их эксплуатации значительно выше, чем обычных ферментеров не требующих освещения. Снижение выхода биомассы бактерий в аэробных темновых условиях культивирования по сравнению с анаэробными темновыми (170 мкг/мл на свету и 52 мкг/мл в темноте) при примерно одинаковом выходе ПБМК (69.5 и 60.0 соответственно) компенсируется существенным упрощением и снижением стоимости культивирования ЯЬа. sphaeroides в качестве продуцента целевого продукта.
Активность ферментов ЦТК. Для выяснения механизма стимуляции синтеза ПБМК при несбалансированном по углероду и азоту росте ЯЬа. sphaeroides измеряли активность ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК). При росте ЯЬа. sphaeroides на среде с ацетатом в качестве ед
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.