научная статья по теме НАНОЧАСТИЦЫ СЕРЕБРА ИНДУЦИРУЮТ ПРОЦЕССЫ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОВЕРХНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА Биология

Текст научной статьи на тему «НАНОЧАСТИЦЫ СЕРЕБРА ИНДУЦИРУЮТ ПРОЦЕССЫ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОВЕРХНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА»

== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =

УДК 575.1/2:612.017:504.05

НАНОЧАСТИЦЫ СЕРЕБРА ИНДУЦИРУЮТ ПPОЦЕССЫ ПЕРЕКИ СНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОВЕРХНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

© 2014 г. Е.В. Жорник, Л.А. Баранова, Е.С. Дрозд*, М.С. Судас*, Н.Х. Тьяу**, Н.К. Быу**, Ч.Т.Н. Зунг**, С.А. Чижик*, И .Д. Волотовский

Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси, 220072, Минск, ул. Академическая, 27, Беларусь; *Институт тепло- и массообмена им. А .В. Лыкова НАН Беларуси, 220072, Минск, ул. П. Бровки, 15, Беларусь;

**Институт технологий окружающей среды, ВАНТ, Xаной E-mail: т344@[Ър.ог%.Ъу Поступила в p едакцию 26.09.13 г.

Изучено влияние наночастиц серебра, синтезированных методом обратного мицеллообразо-вания, на процессы перекисного окисления липидов и морфологические изменения мембран клеток лимфоцитов человека. Показано, что под влиянием наночастиц наблюдается снижение жизнеспособности клеток и образование избыточных количеств активных форм кислорода. Наночастицы серебра при различных концентрациях активируют процессы перекисного окисления липидов и, как следствие, приводят к морфологическим изменениям мембран лимфоцитов человека.

Ключевые слова: наночастицы серебра, лимфоциты крови, активные формы кислорода, перекисное окисление липидов, структура мембраны.

Создание наноматериалов и развитие нано-технологий занимают в настоящее время доми-нир ующее положение практически во всех областях современной науки и техники. В основе научно-технического прорыва на наноуровне лежит использование новых, р анее не известных свойств и функциональных возможностей материальных систем при переходе к наномас-штабам, определяемых особенностями процессов перено са и распределения зар ядов, энергии, массы и информации при наноструктурирова-нии. П рименение продуктов нанотехнологий в настоящее вр емя расширяется во всех областях жизнедеятельно сти человека. Необходимо целенаправленное и всестороннее изучение потенциальных экологических эффектов наночастиц, в том числе наночастиц серебра, поскольку они производятся в больших количествах и находят широкое применение в медицине, технике и производстве. В связи с этим возникла необходимость изучения биологических эффектов различных наночастиц и нанокомпозитных материалов, прежде всего действия их на организм

Сокращения: ПОЛ - перекисное окисление липидов, TBS -трис-слолевой буфер, МТТ - 3-[4,5-диметилтиозол-2-ил]-2,5-дифенил тетразолиум бромид, DCFH-DA - дихлор-флуоресцин диацетат, АСМ - атомно-силовая микроскопия, АФК - активные формы кислорода.

человека и животных. Главная задача здесь состоит в определении степени токсичности наночастиц для человека и, соответственно, потенциального риска использования наночастиц и препаратов на их основе. Наибольший интерес представляют исследования биологического действия металлических наночастиц, так как они наиболее часто служат объектом прикладных р азработок в различных областях про -мышленности и медицины. За последнее десятилетие накоплены данные как о положительном (лечебный эффект), так и об отрицательном (стимуляция возникновения р азличных заболеваний) воздействии наночастиц металлов на живые организмы. Одним из наиболее популяр ных объектов исследований являются наночастицы серебра, поскольку они активно используются в последнее время в производстве различных товаров широкого потребления -пищевых добавок, одежды, бытовой техники, игрушек и др. Наночастицы сереб ра применяются, в частности, в спектр ально-селективных покрытиях для поглощения солнечной энергии, в качестве катализаторов химических реакций или для антимикробной стерилизации [1].

Работы последнего плана проводятся главным образом на бактериях с целью определения антимикробной активности наночастиц [1,2] или на клеточных культурах in vitro [3]. Данные

о действии наночастиц серебра и других металлов на высшие организмы немногочисленны. И сследования последних лет показали, что на-ночастицы серебра являются потенциально токсичными и для клеток млекопитающих. Установлено, что наночастицы серебра, используемые при производстве медицинских повязок, при контакте с кожей человека способны оказывать токсическое действие на кератиноциты и фибробласты [4]. В ряде работ было показано, что наночастицы серебра приводят к снижению жизнеспособности, увеличению выхода лактат-дегидрогеназы и ингибированию функций митохондрий в клетках печени крыс [5], зародышевых стволовых клеток мышей [6], человеческих фибробластов [7] и клеток надпочечников крысы [8]. К роме того, в работе [9] было про -демонстр ир овано дозозависимое изменение показателей щелочной фосфатазы и холестерина, что может являться следствием повреждения печени у крыс после 28-дневного орального введения наночастиц серебра.

Взаимодействие наночастиц с живыми организмами осуществляется с участием иммунной системы. В этой связи особый интерес связан с изучением влияния наночастиц серебра на клетки лимфоцитов человека и последствий этого контакта. Актуальным становится вопрос, какие молекулярные события способны вызывать наночастицы на клеточном уровне. Осо-бый интерес вызывает при этом возможность развития процессов перекисного окисления ли-пидов (ПОЛ), которые, как следует из работ Ю .А. Владимир ова [10,11], носят повсеместный хар актер и индуцируются самыми разными экзогенными факторами. Наконец, с ПОЛ тесно сопряжены структурные преобразования клеточных компонентов и в первую очередь биологических мембран.

Целью настоящей работы является исследование влияния наночастиц серебра на жизнеспособность лимфоцитов человека, процессы перекисного окисления липидов и структуру поверхности клеточной мембраны.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение лимфоцитов из периферической крови. В качестве объектов исследования использовали лимфоциты периферической крови здор овых доноров, полученной в Республиканском научно-практическом центре гематологии и трансфузиологии. Наночастицы серебра были получены в Институте технологии окружающей среды Вьетнамской академии наук и технологии методом обратного мицеллообразования с ис-

пользованием хитозана в качестве стабилизатора [12].

К 10 мл крови добавляли равный объем трис-солевого буфера (ТВБ) (0,14 М КаС1, 5 мМ КС1, 25 мМ трис-НС1, рН 7,4). Смесь наслаивали при комнатной температуре на равный объем среды для выделения лимфоцитов (р = 1,077), содержащей 9 и 34% ра створы фиколла и урографина соответственно. После 10 мин центрифугир ования при 1500 об/мин слой лимфоцитов (кольцо на разделе двух фаз) отбирали и разводили в большом объеме буфера ТББ. После повторного 7-минутного центрифугиро-вания при тех же условиях проводили лизис остаточных эритроцитов, которые тщательно суспендировали в 1 мл холодной воды (mШiQ), а затем добавляли к смеси 1 мл 0,3 М КаС1 и ТББ-буфер. После 7 мин центрифугирования при 1500 об/мин лимфоциты суспендировали в ТББ-буфере и подсчитывали их количество в камере Горяева.

Оценка жизнеспособности лимфоцитов.

Оценку жизнеспособности лимфоцитов при действии на них искусственных наноструктур про -водили с помощью МТТ-теста [13]. Метод оценки жизнеспособности клеток основан на способности митохондриальных дегидрогеназ живых клеток конвертировать растворимую тет-разолиевую соль 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил тетразолиум бромид (МТТ) в нерастворимый формазан. Мертвые клетки не способны столь же эффективно редуцир овать МТТ. Перевод фор мазана в раствор с помощью подходящих органических растворителей, в нашем случае закисленного изопропанола, и последующая фотометр ия позволяют точно сопоставить изменение оптической плотности раствор а по отношению к контролю с изменением количества жизнеспособных клеток, поскольку интенсивность окр аски растворимой фор мы форма-зана линейно коррелирует с количеством жизнеспособных клеток в суспензии.

Мононуклеар ные клетки выделяли из гепа-ринизированной венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла-уро-графина. На первом этапе анализа в каждую тестируемую лунку добавляли по 100 мкл клеток, обработанных наночастицами серебра в различных концентрациях. В качестве контроля выступали клетки, не подвергшиеся воздействию нанотрубок. В каждой группе было по четыре дублированных лунки. Далее в каждую лунку добавляли по 20 мкл МТТ и инкубиро -вали в течение 4 ч во влажной ср еде СО2 инкубатора при 37°С. После добавления солю-билизирующего раствора закисленного изопро-панола измеряли оптическую плотность при

длине волны 490 нм. Жизнеспособность клеток рассчитывали по формуле: клеточная жизнеспособность^) = оптическая плотность обработанных клеток/оптическая плотность контрольного обр азца.

Определение уровня окислительных реакций. Выделенные лимфоциты помещали в питательную среду RPMI-1640 (Fermentas, Литва) для культивирования клеток. Суспензию инкубиро -вали 60 мин при 37°С в присутствии 25 мкМ DCFH-DA (дихлорфлуоресцина диацетата). DCFH-DA пр едставляет собой вещество, которое захватывается клетками, где с помощью эстераз превращается в дихлорфлуоресцин. Последний неспецифически взаимодействует с различными активными формами кислорода, окисляясь до дихлорфлуоресцеина, и его можно обнаружить спектрофлуориметрически [14].

Избыток красителя удаляли центрифугиро -ванием, далее о садок растворяли в 1 мл TBS-буфер а. Для изучения образования активных форм кислор ода 200 мкл загруженных лимфоцитов добавляли в кювету, содержащую 1,8 мл TBS-буфера. Через 60 с добавляли наночастицы серебра. Интенсивность флуоресценции, отражающую уровень содержания активных форм кислорода в клетке, измеряли на спектр офлуо-риметре СМ 220 (SOLAR, Беларусь) при

^возб/исп = 488/525 нм.

Определение диеновык конъюгатов. К

0,2 мл суспензии лимфоцитов добавляли 4 мл гептана, 2 мл изопропанола и энергично встряхивали. Затем добавляли 1 мл HCl, рН 2,0 и повторно встряхивали. Через 20-30 мин отбирали верхнюю фракцию, содержащую липиды, и измеряли ее оптическую плотность при длине волны 233 нм. Расчет концентрации коньюги-рованных диенов осуществляли с использованием едк = 2,2-105 М-1см-1 и выражали в мкмоль/мг белка.

Определение малонового

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком