БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, c.1033-1037
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 612.74:591.175
НАРУШЕНИЯ В РАБОТЕ РИАНОДИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ КАРДИОМИОЦИТОВ СПОНТАННО ГИПЕРТЕНЗИВНЫХ КРЫС, ВЫЯВЛЕННЫЕ С ПОМОЩЬЮ 4-ХЛОР-.М-КРЕЗОЛА
© 2008 г. Г.Б. Белоетоцкая, Е.А. Захаров, Н.З. Клюева*, Е.И. Петрова*, Г.А. Наеледов
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, 194223, Санкт-Петербург,
пр. Тореза, 44;
E-mail: gbelost@mail.ru
*Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 190034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6
Поступила в редакцию 26.06.08 г.
2+
Изучена скорость высвобождения Са из саркоплазматического ретикулума при активации рианодиновых рецепторов с помощью 4-хлор-м-крезола в кардиомиоцитах крыс трех линий: спонтанно гипертензивных (SHR), их нормотензивного контроля (WKY), а также крыс линии Wistar на протяжении пяти недель их роста и развития с целью выявления функциональных различий в работе рианодиновых рецепторов на разных эт^^лах формирования артериальной гипертензии. На фоне снижающейся скорости выброса Са из саркоплазматического ретикулума в кардиомиоцитах крыс линий Wistar и WK+Y в ответ на действие 4-хлор-м-крезола выявлено резкое увеличение скорости нарастания [Са ]i после 17-дневного возраста в миоцитах SHR. Предполагаемая связь этого явления с наличием генетического дефекта рианодиновых рецепторов у крыс SHR кажется маловероятной, так как при действии 4-хлор-м-крезола в диапазоне концентраций 0,5 - 2,0 мМ у новорожденных животных линий WKY и SHR не зарегистрировано различий в скорости высвобождения Са из саркоплазматического рети-кулума. С другой стороны, возможно, что патологические изменения функции рианодиновых рецепторов проявляются в ходе онтогенеза позднее. Обсуждается связь этого явления с увеличением роли рианодиновых рецепторов в процессе электромеханического сопряжения мышечных клеток и с возрастанием у крыс линии SHR, но не у WKY, экспрессии кальпаина к трехнедельному возрасту. Предполагается, что расщепление субъединицы рианодиновых рецепторов кальпаином может, не влияя на характеристики связывания рецептора, заметно усиливать выброс кальция в цитоплазму из саркоплазматического ретикулума при активизации рианодиновых рецепторов.
Ключевые слова: гипертензия, крысы линии SHR, кардиомиоциты, рианодиновые рецепторы, 4-хлор-м-крезол.
В настоящее время общепризнан тот факт, что в патогенезе артериальной гипертензии важнейшую роль играют нарушения метаболизма кальция. При устойчивом повышении сосудистого тонуса нарастание уровня Са2+ в цитозоле обнаруживается в различных клетках сердечно-сосудистой системы: гладкомышечных клетках сосудов, эритроцитах, тромбоцитах и кардиомиоцитах. В формировании этого эффекта могут принимать участие различные механизмы. Так, установлена связь между формированием гипертензии и развитием патологии клеточных мембран [1]. У крыс со спонтанной гипертензией (БИЯ), которые широко
Сокращения: CP - саркоплазматический ретикулум, РиР -рианодиновые рецепторы, ЭМС - электромеханическое сопряжение.
используются в качестве соответствующей экспериментальной модели, описано повышение содержания Са2+ в саркоплазматическом рети-кулуме (СР) [2] и величины тока через Са2+-каналы по сравнению с нормотензивными крысами линии WKY [3].
Таким образом, хотя наличие нарушений метаболизма кальция в клетке при развитии артериальной гипертензии можно считать установленным, однако отдельные механизмы, участвующие в становлении этой патологии, и конкретные детали данного процесса изучены еще недостаточно. Особый интерес вызывают изменения в таких условиях функционирования сердечной мышцы и кардиомиоцитов. Известно, что мембранные потенциал-зависимые Са2+-каналы, запускающие сокращение сердечной мышцы [4], открываются под влиянием потен-
циала действия желудочка, и при последующем локальном увеличении [Са2+] происходит массовый выход кальция из СР через рианодин-чувствительные Са2+-каналы (РиР) [5] с помощью механизма Са2+-индуцированного высвобождения Са2+. В сердце взрослых крыс эта последовательность событий, обозначаемая как С1СЯ, является преобладающим механизмом в процессе электромеханического сопряжения (ЭМС).
Однако в эмбриональном периоде С1СЯ, по-видимому, отсутствует и появляется только через несколько дней после рождения [6-8]. В работе [9] при определении вклада сарколемм-ного кальция и Са2+, вышедшего из СР, в формирование Са2+-ответа в течение первых трех недель постнатального развития было показано, что сразу после рождения (одного -пяти дней) наблюдается преобладание входа сарколеммного Са2+, а в возрасте трех недель более важным становится С1СЯ из саркоплаз-матического ретикулума.
Артериальная гипертензия у крыс БИЯ формируется в процессе онтогенеза поэтапно, проходя три стадии: предгипертензионную (до 6 недель), стадию формирования гипертензии (с 6 до 12 недель) и стадию выраженной гипер-тензии (от 12 до 24 недель). Представляет большой интерес выявление роли рианодиновых рецепторов и участия С1СЯ в повышении концентрации внутриклеточного кальция в ходе формирования устойчивой артериальной гипер-тензии. Поэтому в данной работе было проведено сравнительное исследование на кардио-миоцитах крыс трех линий: спонтанно гипер-тензивных (БИЯ) и их нормотензивного контроля ^КУ), а также крыс на протяжении пяти недель их роста с целью выявления функциональных различий в работе рианоди-новых рецепторов на разных этапах формирования артериальной гипертензии с помощью 4-хлор-ж-крезола, сравнительно нового активатора рианодиновых рецепторов, который используется в эксперименте не так часто, как кофеин.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили на крысах линии БИЯ в возрасте от 1-2 до 35 дней постнаталь-ного развития и соответствующих им по возрасту нормотензивных крысах линий WKY и в качестве контроля. Использовали как свежевыделенные, так и культивируемые кар-диомиоциты крыс различного возраста. Крыс усыпляли с помощью углекислого газа. Клетки сердца выделяли по модифицированному методу [10]. Отпрепарированные сердца тщательно измельчали и инкубировали при 37°С в течение 20 - 50 мин (в зависимости от возраста) в
растворе Рингера: 146 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, 11 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES (pH 7,4), содержащем коллагеназу IA типа (1 мг/мл, Sigma) и трипсин (0,12%, Биолот). После фильтрации и центрифугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин клетки переносили в питательную среду, состоящую из среды DMEM с добавлением 10% эмбриональной сыворотки, 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Для удаления примесных немышечных клеток суспензию высевали на стеклянные чашки Петри и инкубировали в течение 45 - 50 мин при 37°C. Затем непри-крепившиеся клетки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре на полосках покровных стекол (12 х 24 мм), предварительно покрытых поли-Д-лизином (0,1 мг/мл, MP Bi-omedkals). Дальнейшие эксперименты проводили на свежевыделенных или культивируемых в течение пяти дней кардиомиоцитах. Для измерения внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция - [Ca2+]i - клетки инкубировали в растворе Рингера с флуорохромом Fura-2AM (Sigma) в концентрации 10 мкМ в течение 1 ч при 26°C.
Регистрацию ^а2+] осуществляли с помощью компьютерной системы анализа внутриклеточного содержания ионов (^гасеИикг Imaging & Photometry System, CfflA). Возбуждение образца проводили при 340 и 380 нм, а эмиссию регистрировали при 510 нм. C помощью компьютерной программы InCytIm2TM рассчитывали концентрацию ионов кальция как соотношение интенсивностей флуоресценции (^340/^380) с учетом калибровочной кривой [11].
Активность рианодиновых рецепторов оценивали по наличию Cа2+-ответов на действие кофеина (5 - 20 мМ) и 4-хлор-.-крезола (0,25 - 3,0 мМ). ^орость высвобождения кальция из CP в ответ на действие кофеина и 4-хлор-м-крезола рассчитывали с использованием кальциевых кривых путем деления величины нарастания ^а2+] (от начального уровня до максимального значения - пика) на время, в течение которого этот процесс происходил. Полученные величины выражали в нМ/с.
При обработке результатов данные каждого эксперимента усредняли по находящимся в поле зрения микроскопа клеткам, а также усредняли данные нескольких повторов и различных экспериментов с одинаковыми условиями проведения. Полученные величины представлены как среднее ± ошибка среднего (M ± m).
PЕЗУЛЬТAТЫ
Было показано, что свежевыделенные кар-диомиоциты новорожденных крыс отвечают кратковременным повышением [Ca2+]i на дей-
Концентрация, мМ
Рис. 1. Скорости высвобождения Са2+ из СР в ответ на действие 4-хлор-м-крезола в различных концентрациях в кардиомиоцитах крыс линий Wistar (1), WKY (2) и БИЯ (5) на пятый день развития в культуре: (а) -новорожденные крысы; (б) - 17-дневные крысы; (в) - 35-дневные крысы.
ствие кофеина в концентрациях 5-10 мМ. При действии кофеина в концентрации 5 мМ для неонатальных крыс линии БИЯ скорость высвобождения Са2+ из СР (10,2 ± 1,4 нМ/с) была практически одинаковой по сравнению с нормотензивными крысами линий WKY (7,26 ± 3,19 нМ/с) и Wistar (6,75 ± 1,93 нМ/с) этого возраста. Однако у крыс после пяти суток развития Са2+-ответ на введение кофеина не удавалось зарегистрировать даже при увеличении концентрации до 20 мМ, при том что устойчивый Са2+-ответ на действие 4-хлор-м-крезола наблюдался у исследованных линий крыс всех возрастных групп. Но при этом результаты, полученные на свежевыделенных кардиомиоци-тах, особенно для крыс более старшего возраста (17 - 35 дней), были нестабильные, что, по всей видимости, связано с повреждением рецепторов во время ферментативного разрушения сердечной мышцы. Однако нами было установлено, что при культивировании миоцитов активность рианодиновых рецепторов восстанавливается - практически все клетки отвечали на введение 4-хлор-м-крезола в той или иной концентрации. Поэтому для оценки функционирования рианодиновых рецепторов мы остановились на 5-суточном сроке культивирования кардиомиоцитов, и именно 4-хлор-м-крезол был выбран в качестве основного инструмента.
На рис. 1 представлены концентрационные кривые скорости высвобож
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.