БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, c.972-977
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 576.311.3:576.535.5
НАРУШЕНИЕ РАДИАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ИНТЕРФАЗНЫХ МИКРОТРУБОЧЕК ПРИ ИЗБЫТКЕ СЫВОРОТКИ В СРЕДЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
© 2008 г. Е.В. У сова*, А.В. Бураков*, А.А. Шпильман*, Е.С. Надеждина* **
*Научно-исследователъский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Воробъевы горы; **Институт белка РАН, 142290, Пущино Московской области Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Изучена роль упорядоченности микротрубочек в клетке. Для этого использована популяция клеток Vero с хаотичным расположением микротрубочек, полученная при добавлении избытка сыворотки в среду культивирования. В таких клетках наблюдали увеличение общей площади и некоторую дисперсию аппарата Гольджи, однако скорость роста культуры в целом оставалась нормальной. Установлено, что радиальное расположение микротрубочек не является жизненно важным даже для клеток, в которых оно обычно хорошо выражено.
Ключевые слова: микротрубочки, эмбрионалъная сыворотка, среда кулътивирования, аппарат Голъджи, рана монослоя, протеинкиназа GSK-3Q.
Микротрубочки (МТ) являются одним из основных элементов цитоскелета животных клеток. Система микротрубочек обеспечивает множество важных клеточных функций, таких как внутриклеточный транспорт органелл в интерфазе или расхождение хромосом при митозе.
Микротрубочки в интерфазных клетках животных часто расположены радиально и организованы в виде звезды. Считается, что именно благодаря радиальности микротрубочек, отходящих от центросомы к периферии клетки, осуществляется эффективный внутриклеточный транспорт и другие жизненно важные процессы в клетке. Тем не менее, как показывает практика, в интерфазе клеточного цикла далеко не во всех клетках микротрубочки расположены упорядоченно. Даже в культивируемых фиброб-ластоподобных клетках, где радиальность микротрубочек наиболее выражена, как минимум 20% клеток в популяции демонстрируют хаотичное расположение микротрубочек. В клетках же других линий микротрубочки могут быть неупорядочены вовсе. Например, клетки широко используемой линии ИеЬа (карцинома шейки матки человека) в половине случаев содержат неупорядоченную систему микротрубочек. Однако клетки данной линии интенсивно делятся, хорошо проникают в рану монослоя и
Сокращения: МТ - микротрубочки, ФСБ - фосфатно-со-левой буфер, МТТ - 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифе-нилтетразолий бромид.
отнюдь не отличаются пониженной жизнеспособностью. Более того, хорошо известно, что при культивировании клеток радиальная система микротрубочек наблюдается лишь в разреженном монослое. По достижении клетками состояния конфлюэнтного монослоя микротрубочки в них постепенно теряют радиальность. В некотрых эпителиальных культурах, когда клетка уже тесно сжата со всех сторон своими соседями, микротрубочки в ней расположены пучками параллельно краю клетки. Мало того, что такие клетки жизнеспособны - такое их состояние тесного соседства как раз является максимально приближенным в условиях in vitro к нативному состоянию в тканях животного.
Таким образом, роль радиальной упорядоченности микротрубочек в интерфазной клетке к настоящему моменту неясна. Целью нашей работы было выяснение этой роли в культивируемых клетках млекопитающих. Известно достаточное количество способов нарушить упорядоченность системы клеточных микротрубочек - от добавления в культуральную среду таксола, стабилизирующего микротрубочки [1], до применения различных ингибиторов дине-ин-динактинового комплекса, нарушающих работу этого минус-концевого мотора [2]. Однако все они имеют ярко выраженные побочные эффекты, нарушающие нормальную жизнедеятельность клетки. Недавно было показано, что к хаотизации микротрубочек в клетке ведет ин-гибирование протеинкиназы GSK-3P путем
РНК-интерференции [3]. Известно, что GSK-3P в клетках может быть ингибирована добавлением в культуральную среду инсулина [4] или хлорида лития [5]. Кроме того, недавно были получены данные, что добавление в среду эпи-дермального фактора роста также ведет к дезорганизации системы микротрубочек в клетках [6].
Мы подобрали условия культивирования клеток Vero таким образом, чтобы получить жизнеспособную популяцию, в которой у большинства клеток микротрубочки не радиальны. Таким условием оказалось повышенное содержание эмбриональной сыворотки в среде культивирования, коррелирующее с инактивацией протеинкиназы GSK-Зр. После этого мы проанализировали морфофункциональные характеристики данных клеток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Культуру клеток Vero (эпителий почки зеленой мартышки) выращивали при температуре 37°С и содержании углекислого газа 5% на среде, состоящей из 50% DMEM и 50% F12 («Панэко», Россия), с добавлением 7,5% или 18,5% эмбриональной телячьей сыворотки крови («Панэко», Россия) и 80 мкг/мл гентамицина. Для пересева клеток использовали смесь трип-син/версен («Панэко», Россия).
Перед иммунофлуоресцентным окрашиванием клетки фиксировали абсолютным метанолом при -20°С в течение 5 мин, затем в 3% параформальдегиде на фосфатно-солевом буфере (ФСБ) при +4°С в течение 15 мин и промывали ФСБ комнатной температуры три раза по 10 мин.
Для иммунофлуоресцентного окрашивания использовали моноклональные антитела к а-тубулину DM-1A (Sigma, США), кроличьи антитела к маннозидазе II (АЬсат, США), к у-тубулину (любезно предоставлены Р.Э. Узбеко-вым) и к найнеину (АЬсат, США).
Электрофорез и иммуноблоттинг проводили, как описано ранее [7], использовали антитела к GSK-3P и к Р-GSK^P (Се11 Signaling Tedrnology, США).
Экспериментальную рану наносили на монослой, как описано ранее [8]. Разборку микротрубочек в клетках для их последующего восстановления проводили добавлением в куль-туральную среду нокодазола в концентрации 2 мкг/мл.
Для оценки пролиферации клеток использовали МТТ-тест, основанный на превращении живыми клетками желтого МТТ (3-(4,5-диме-
тилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромида) в водонерастворимый синеокрашенный фор-мазан под действием сукцинатдегидрогеназы, локализованной в мембранах митохондрий.
Для оценки радиальности системы микротрубочек применяли три различных способа анализа цифровых фотографий фиксированных клеток, окрашенных антителами к тубулину (рис. 1). Во-первых, это была визуальная оценка; во-вторых, оценка с помощью программы Metamo^h версии 4.6 (Universal Imaging Cor-рога1гоп, США). В этом случае измеряли среднюю флуоресценцию по всей площади клетки и затем отдельно в центральной области. За центральную область принимали круг с центром, расположенным в центроиде клетки, площадь которого составляла 15% от всей площади клетки. Затем вычисляли коэффициент радиальности, представляющий собой отношение этих двух величин. Если коэффициент радиальности был больше 1,5, считали, что система микротрубочек в клетке радиальна, если меньше 1,5 - что радиальность микротрубочек в клетке нарушена. Наконец, радиальность расположения микротрубочек оценивали с помощью программы Fluorescence, написанной в нашей лаборатории специально для этой цели (рис. 1б,в). Эта программа позволяет измерить падение флуоресценции по мере удаления от центра клетки. При этом пользователю нужно только открыть необходимый файл с микрофотографией, курсором отметить центр клетки и точки на ее крае, к которым будут проведены радиусы, и задать размер участков измерения флуоресценции и шаг измерения. Полученные данные программа записывает в виде log-файла, при этом единицы измерения флуоресценции автоматически переводятся в проценты от максимального уровня флуоресценции в центральной точке. Когда система микротрубочек в клетке строго радиальна, происходит резкое падение флуоресценции от центра к краю клетки (на графике). Если система микротрубочек неупорядочена, после некоторого понижения уровня флуоресценции, график выходит на плато. По визуальной оценке, 75% контрольных клеток имели радиальную систему микротрубочек, по оценке программы Metamo^h - 94%. С помощью программы Fluorescence проводили проверку случайно выбранных клеток на радиальность в них микротрубочек, и во всех случаях оценка с помощью программы Fluorescence совпадала с таковой как при анализе с помощью программы Metamo^h v.4.6, так и при более строгом визуальном анализе.
Su= 0.15 S0
/fp = fl(Su)/fl(S0) (б)
*J.
Wk
.. Ш
у i\> V. ; 4 /"■■ /¿з
* \ '
И/.' 'в-'-- '
v7w
Я Л
5
i о О
и н О
Хаотичные МТ
Радиальные МТ
Рис. 1. Измерения радиального расположения клеточных микротрубочек. (а) - Схема оценки радиальности микротрубочек при помощи программы Ме1ашогрЪ. На снимках клеток с иммунофлуорес-центно окрашенными микротрубочками определяют интегральную флуоресценцию по всей площади клетки £о и в центральной области £ц. Коэффициент радиальности представляет собой отношение этих двух величин. (б) - Рабочее окно программы Б 1иогеБсепсе. После указания центральной точки клетки и направлений радиусов, шага измерения и площади измеряемых областей, программа автоматически записывает в журнал численные данные для построения графика по флуоресценции микротрубочек в направлении от центра к краю клетки. Пример таких графиков приведен на (в), за 100% принят уровень флуоресценции в центральной точке: 1 - клетка с радиальным расположением микротрубочек; 2 - клетка с хаотичными микротрубочками. В обоих случаях усреднены пять радиусов клетки.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Клетки Vero, культивирующиеся в нормальных условиях (7% эмбриональной телячьей сыворотки или сыворотки новорожденных телят), в субконфлуентном монослое обладают выраженной радиальной системой микротрубочек. Первой задачей нашего исследования было получение нормально пролиферирующих клеток с хаотичными микротрубочками. Мы добавляли инсулин (20 мкг/мл) или хлорид лития (5 мМ) к клеткам культуры Vero и оценивали радиальность микротрубочек в клетках спустя 1 месяц после начала эксперимента, пересевая клетки всякий раз при достижении конфлуент-ного монослоя или меняя среду на свежую каждые три - четыре дня. Наблюдали снижение степени радиальности микротрубочек
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.