ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 3, с. 303-314
^=ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ =
УДК 576.311.342:581.198
НАРУШЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ХЛОРОПЛАСТОВ ПРИ БЛОКИРОВКЕ БИОСИНТЕЗА 5-АМИНОЛЕВУЛИНОВОЙ
КИСЛОТЫ НА СВЕТУ
© 2007 г. В. Г. Ладыгин
Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290 Пущино, Московская обл.
E-mail: ladyginv@rambler.ru Поступила в редакцию 16.06.2006 г.
Установлено, что у мутанта xantha-702 хлопчатника (Gossypium hirsutum L.) на свету блокирован синтез 5-аминолевулиновой кислоты. Поэтому в листьях мутанта накапливается 2-5% хлорофилла от контрольного уровня. У мутантных растений нарушено образование пигмент-белковых комплексов ФС-I и ФС-II и останавливается формирование мембранной системы хлоропластов на ранних этапах, в большинстве случаев, на стадии пузырьков и единичных коротких тилакоидов. Функциональная активность реакционных центров ФС-I и ФС-II близка к нулю. У мутанта xantha-702 формируются только светособирающие хлорофилл-а^-белковые комплексы ФС-I и ФС-II с максимумами флуоресценции хлорофилла при 728 и 681 нм, соответственно. Высказывается предположение о том, что у мутанта xantha-702 на свету генетическое блокирование биосинтеза хлорофилла на этапе синтеза 5-аминолевулиновой кислоты нарушает формирование и активность комплексов реакционных центров ФС-I и ФС-II и тормозит развитие всей мембранной системы хлоропластов.
Во многих исследованиях хлорофиллдефицит-ных мутантов было обнаружено большое число ядерных и хлоропластных генов, контролирующих как цепь биосинтеза пигментов, так и синтез белковых компонентов фотосинтетических мембран (Jansson et al., 1992; Henningsen et al., 1993). Мутационные изменения таких генов препятствуют развитию и нормальному функционированию пластид, а также обусловливают снижение содержания хлорофилла (Jansson, 1994; Krol et al., 1995; Falbel, Staehelin, 1996).
Большая коллекция индуцированных хлоро-фильных мутаций ячменя (Hordeum vulgare L.) впервые была описана Густавсоном в Швеции еще в 1940 г. Он разделил пигментные мутанты на группы: albina, xantha, alboviridis, viridis, tigrina, chlorina, virescence и др. У ячменя были идентифицированы многие ядерные и хлоропластные гены, влияющие на биосинтез пигментов (Harrison et al., 1993; Prina et al., 2003). Выявлено также множество мутантов у гороха (Pisum sativum L.), имеющих генетические нарушения биосинтеза хлорофилла и каротиноидов (Гостимский и др., 1991; Ладыгин и др., 2003). Получены такие мутанты у сои (Glicine max. L.), кукурузы (Zea mays L.), пшеницы (Falbel et al., 1994, 1996), хлопчатника (Наджимов и др., 1985), подсолнечника (Усатов и др., 2004), Arabi-dopsis thaliana (Pogson et al., 1998; Cunningham, Gantt, 2001; Babiychuk et al., 2003) и у Chlamydomo-nas reinhardtii (Чунаев, 1994; Ладыгин, 1998; Harris, 2001).
Пигментные мутанты в соответствии с имеющейся классификацией делятся на 3 группы. В первую входят одноцветные пигментные мутанты - белые, желтые, светло-зеленые и темно-зеленые (Ладыгин и др., 1973; Гостимский и др., 1991). Во вторую группу включены пестролистные формы с разной окраской листьев - пятнистой или полосатой. Третья группа - мутанты virescence - растения, у которых в процессе онтогенеза наблюдается изменение окраски листьев (обесцвечивание или зеленение) от светло-зеленой до желтой и белой или от белесой до полностью зеленой. Наблюдаемые изменения в пигментации связаны с фотовыцветанием или, напротив, со стабилизацией молекул хлорофилла в ходе биогенеза хлоропластов (Усатов и др., 2004). Уровень образования хлорофилла изменяется и зависит от условий среды, в которых выращиваются растения.
Степень формирования и развития мембранной системы хлоропластов, как правило, коррелирует с накоплением хлорофилла (Ладыгин, Семенова, 1993; Ладыгин, 2005). Сейчас известно, что пространственная упаковка тилакоидов в хлоропластах зависит от состава пигмент-белковых комплексов фотосистем I и II (ФС-I и ФС-II) (Ладыгин, 1998; Anderson, 1999; Staеhelin, 2003). Было показано, что у мутантов, утративших комплексы реакционных центров ФС-I, редуцируются межгранные участки тилакоидов. Напротив, при потере комплексов реакционных центров ФС-II в хлоропластах мутантов происходит раз-
липание тилакоидов в гранах и мембранная система хлоропластов состоит из тяжей хорошо развитых единичных тилакоидов (Ладыгин, 1998).
Установлено, что пропорциональное уменьшение комплексов ФС-I и ФС-II у мутанта chlorot-ica сопровождалось частичной редукцией всей мембранной системы хлоропластов, но с наличием как гранальных, так и межгранных участков тилакоидов. Напротив, потеря комплексов реакционных центров ФС-I у мутанта chlorotica ведет к редукции в хлоропластах, главным образом, межгранных участков тилакоидов (Ладыгин и др., 2003).
Известно, что хлорофильные мутанты с нарушениями ядерных и хлоропластных генов широко используются для установления взаимосвязи между геном и признаком (Jansson et al, 1992; Henningsen et al., 1993; Prina et al., 2003). Создание мутантных систем различной степени сложности представляется чрезвычайно важным (Ладыгин, 1998; Cunningham, Gantt, 2001). На базе Ташкентского университета у хлопчатника были получены мутантные линии xantha и viridis (Наджимов и др., 1985; Санамьян, 2003), которые позволяют изучать ранние этапы образования и функционирования фотосинтетических мембран хлоропластов.
Цель данной работы состояла в том, чтобы установить место нарушения биосинтеза хлорофилла у мутанта xantha-702 и выяснить роль блокировки синтеза 5-аминолевулиновой кислоты на свету на состав пигмент-белковых комплексов, ультраструктурную организацию хлоропластов и фотохимическую активность реакционных центров ФС-I и ФС-II.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект. В исследованиях использовали семядольные листья исходной линии Л-702 и мутанта xantha хлопчатника (Gossypium hirsutum L.). Мутант xantha-702 был выделен после обработки 0.025%-ным раствором К-нитрозо-К-этилмоче-вины в течение 24 ч семян гибрида хлопчатника первого поколения (F1) от скрещивания двух линий Л-73 х Л-453 (Наджимов и др., 1985; Шегай, 1993).
В исследованиях гетерозиготных растений было установлено, что мутация xantha-702 дает расщепление по Менделевскому типу на два фенотипа: зеленые и желтые в соотношении 3 : 1 (Наджимов и др., 1985). Обнаруженная закономерность эффекта ядерных генов была стабильной и проявлялась в последующих поколениях. На основании полученных данных был сделан вывод о том, что мутация xantha-702 является моногенной, рецессивной, ядерной.
В качестве родительского типа мы использовали проростки зеленых гомозиготных растений линии Л-702, семядольные листья которых после 4-8 сут темноты и 1 сут освещения синтезировали
хлорофилл в количестве, достигающем 60-80% от максимального, характерного для световых проростков. У мутантных растений xantha-702 того же возраста, гомозиготных по мутантной рецессивной аллели гена xan, хлорофилл практически не обнаруживался, либо накапливался в количестве 2-5% от нормы.
Условия роста. Этиолированные 4-9-суточ-ные проростки обоих типов, полученные проращиванием семян при 22°С в темноте в рулонах из фильтровальной бумаги на дистилированной воде, были фенотипически желтыми. Для изучения процесса зеленения этиолированные проростки родительского типа и мутанта xantha-702 после 4-8 сут роста в темноте мы освещали постоянным светом (4000 лк или 12 Вт/м2) в течение 1 или 5 сут.
Определение пигментов. Содержание хлоро-филлов а и b и каротиноидов в этиолированных и зеленеющих семядольных листьях проростков родительского типа и мутанта xantha-702 определяли в 80 или 100%-ных ацетоновых экстрактах с помощью спектрофотометра Hitachi-356 (Япония) и рассчитывали по формулам (Lichtenthaler, 1987).
Для определения содержания 5-аминолевулиновой кислоты, а также содержания протохлоро-филлида использовали методы описанные ранее (Аверина и др., 1992; Шегай, 1993).
Оценку способности мутанта xantha-702 формировать пигмент-белковые комплексы можно провести методом гель-электрофореза или спектральными методами. Мы использовали методы низкотемпературной абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии.
Спектры поглощения хлорофилла при комнатной температуре (23°С) и температуре жидкого азота (-196°С) и их вторые производные регистрировали с помощью двухлучевого и двухвол-нового спектрофотометра Hitachi-356. Условия и режим записи спектров описаны ранее (Ладыгин, 1998). Образцы помещали в кювету толщиной 0.1 см и записывали спектры при АХ = 1-2 нм.
Спектры флуоресценции хлорофилла и их вторые производные регистрировали при температуре жидкого азота (-196°С) на установке, описанной ранее (Лебедев и др., 1991). Флуоресценцию хлорофилла возбуждали синим светом с длиной волны 436 или 480 нм.
Фотохимическая активность. Активность реакционных центров ФС-I и ФС-II определяли по светоиндуцированным изменениям поглощения хлорофилла П700 (АА700 ) для ФС-I и по кинетике переменной флуоресценции хлорофилла (AF) и послесвечения для ФС-II (Ладыгин и др., 1990).
Ультраструктура хлоропластов. Структуру хлоропластов изучали на срезах кусочков семядольных листьев, которые фиксировали 1.25%-ным глутаровым альдегидом на фосфатном буфере pH 7.4 в течение 1.5-2 ч, затем дофиксиро-
Таблица 1. Содержание пигментов в семядольных листьях проростков хлопчатника, росших в темноте, а затем зеленеющих на свету в течение 1 и 5 сут, %
Вариант Время роста (темнота + свет), сут Содержание хлорофилла Содержание каротиноидов
a Ь a + Ь
Родительский тип 9 + 0 2.4 ± 0.4 1.5 ± 0.6 3.9 ± 0.9 6.0 ± 0.4
8 + 1 45.7 ± 4.5 16.9 ± 1.4 62.5 ± 5.5 21.5 ± 0.6
4 + 5 69.7 ± 4.3 30.3 ± 1.8 100.0 ± 5.0 37.8 ± 0.7
Мутант xantha-702 9 + 0 2.3 ± 0.2 1.3 ± 0.1 3.6 ± 0.2 6.4 ± 0.5
8 + 1 1.8 ± 0.2 1.2 ± 0.1 3.0 ± 0.2 4.4 ± 0.4
4 + 5 1.6 ± 0.1 1.1 ± 0.1 2.7 ± 0.1 3.8 ± 0.5
Примечание. Представлены результаты 5 опытов. За 100% принято максимальное содержание суммы хлорофиллов а и I равное 1302 мкг/г сырой массы листьев проростков, росших 4 сут в темноте и 5 сут на свету.
вали 1%-ным OsO4 в течение 2 ч при комнатной температуре. Фиксированн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.