МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2010, том 44, № 5, с. 816-823
= ГЕНОМИКА, ТРАНСКРИПТОМИКА =
УДК 577.29
НЕ ВЫЯВЛЕНО АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФНЫХ ЛОКУСОВ ГЕНОВ ФОЛАТНОГО ЦИКЛА (С677Т И А1298С MTHFR, С1420Т SHMT1 И С1958А MTHFD) С РИСКОМ РАЗВИТИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ЗАПАДНО-СИБИРСКОМ РЕГИОНЕ РОССИИ
© 2010 г. А. С. Вайнер1, 2*, У. А. Боярских2, Е. Н. Воронина2, И. А. Селезнёва3, Т. В. Синкина3, А. Ф. Лазарев3, В. Д. Петрова3, М. Л. Филипенко2
Новосибирский государственный университет, Новосибирск, 630090 2Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, 630090 3Алтайский филиал Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук, Барнаул, 656049 Поступила в редакцию 01.03.2010 г. Принята к печати 30.03.2010 г.
Рак молочной железы — одно из самых распространенных онкологических заболеваний у женщин. Изучена роль аллельных вариантов генов фолатного цикла — С677Т и А1298С гена MTHFR, С1420Т гена SHMT1 и С1258А гена MTHFD — в формировании предрасположенности к этому виду рака. Определены частоты встречаемости аллелей и генотипов указанных однонуклеотидных полиморфизмов в контрольной группе (810 женщин) и в группе больных со спорадической формой рака молочной железы (850 женщин). Ни один из полиморфных локусов не показал статистически значимой ассоциации с риском рака молочной железы. С целью увеличения статистической мощности исследования проведен мета-анализ, в который вошли как опубликованные данные, так и результаты, полученные в нашей работе. В результате мета-анализа не обнаружено статистически значимой ассоциации ни одного из изучаемых полиморфных локусов с риском рака молочной железы.
Ключевые слова: рак молочной железы, русские, гены ферментов фолатного цикла, мета-анализ.
POLYMORPHIC VARIANTS OF FOLATE METABOLIZING GENES (C677T AND A1298C MTHFR, C1420T SHMT1 AND G1958A MTHFD) ARE NOT ASSOCIATED WITH THE RISK OF BREAST CANCER IN WEST SIBERIAN REGION OF RUSSIA, by A. S. Weiner12*, U. A. Boyarskih2, E. N. Voronina2, T. V. Sinkina3, A. F. Lazarev3, V. D. Petrova3, M. L. Filipenko2 ^Novosibirsk State University, Novosibirsk, 630090 Russia; *e-mail: hamlet85@mail.ru; 2Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Division, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, 630090 Russia; 3Altai Branch of Russian Blokhin Cancer Research Centre, Russian Academy of Medical Sciences, Barnaul, 656049 Russia). Breast cancer is the most incident cancer among women. We investigated the role of polymorphisms of folate metabolizing genes MTHFR (C677T and A1298C), SHMT1 (C1420T) and MTHFD (G1258A) in genetic susceptibility to this type of cancer. We determined allele and genotype frequencies in case (850 women with sporadic form of breast cancer) and control (810 women) groups. None of these polymorphisms was significantly associated with breast cancer risk. To increase statistical power of our study, we conducted a meta-analysis which included published genotype data and the results of our work. Metaanalysis also revealed no significant association of studied SNPs with breast cancer.
Key words: breast cancer, Russian population, folate metabolizing genes, meta-analysis.
Рак молочной железы (РМЖ) — одно из самых распространенных среди женщин онкологических заболеваний, его риск составляет 10%, а при наличии РМЖ в семейном анамнезе — как минимум 20% [1, 2]. Как заболеваемость, так и смертность от РМЖ в настоящее время имеют тенденцию к устойчивому
*Эл. почта: hamlet85@mail.ru
росту. Ранняя диагностика обеспечивает успешное лечение большинства больных РМЖ, поэтому поиск биологических маркеров, ассоциированных с прогнозом заболевания и определяющих его особенности, открывает новые возможности для профилактики и выбора тактики лечения.
Рис. 1. Схема фолатного цикла. ДГФ — дигидрофолат, ДМГ — диметилглицин, ТГФ — тетрагидрофолат, BHMT — бетаин-го-моцистеин-метилтрансфераза, CBS — цистатионин-Р-синтаза, CH — метенилтетрагидрофолат-циклогидролаза, DHFR — ди-гидрофолатредуктаза, DNMT — ДНК(цитозин-5-)-метилтрансфераза, FR — фолатредуктаза, FS — формилтетрагидрофолат-синтетаза, FTHFD — формилтетрагиIпрофолатдегидрогеназa, Hcy — гомоцистеин, MAT — метионин-аденозилтрансфераза, Met — метионин, MTHFD — метилентетрагидрофолатдегидрогеназа, MTHFR — метилентетрагидрофолатредуктаза, MTHFS — метенилтетрагидрофолатсинтетаза, MTR — метионинсинтаза, MTRR — редуктаза метионинсинтазы, AHCY — аде-нозилгомоцистеиназа, SAM — S-аденозилметионин, SHMT — серин-гидроксиметилтрансфераза, TYMS — тимидилатсинтаза.
(^Фолат " Y FR
ДГФ
4TR^MTRR BHMT
| SAM .■
.|дмг' .
у
IR [BHM
^ '" '^Бетаин ;
| Холин '■
MTHFD (FS)
Цистатионин
I
Цистеин
Цистатионаза
;<(|днк
DNMT
1 ¡Метилированная ДНК ,
На сегодняшний день идентифицирован ряд вы-сокопенетрантных мутаций, обусловливающих около 10% случаев семейной формы РМЖ [3]. Генетическая предрасположенность к спорадическому РМЖ определяется структурными вариантами различных генов, каждый из которых вносит небольшой вклад в развитие заболевания. К таким генам могут относиться гены ферментов фолатного цикла (схема фолатного цикла представлена на рис. 1). Нарушения баланса в метаболизме фолиевой кислоты влияют на систему метилирования и могут увеличить вероятность злокачественной трансформации клетки [4]. Это может быть связано с подавлением синтеза тимидилата de novo, что повышает вероятность ошибочного встраивания dUMP в ДНК, а вырезание dUMP ДНК-гликозилазой может приводить к возникновению одно- и двухцепочечных разрывов. Другой процесс, кофактором которого является фолиевая кислота, — синтез S-аденозилме-тионина (SAM). При низком содержании SAM в клетке снижается уровень метилирования ДНК, что нарушает сегрегацию хромосом и экспрессию генов [5]. Инактивация генов-супрессоров опухолевого роста вследствие гиперметилирования их промотор-ных регионов, так же как активация протоонкогенов
в результате гипометилирования их промоторных участков, может вызывать селективный рост клеток и их трансформацию [6].
Ассоциации однонуклеотидных замен (8МР) в генах ферментов фолатного цикла с риском развития различных видов рака посвящено достаточно большое количество работ. Например, показана ассоциация аллеля 677Т МТИЕЯ с повышенным риском множественной миеломы [7] и рака пишево-да [8], а также установлен протективный эффект генотипа 677ТТ при раке толстой и прямой кишки [9]. В случае РМЖ результаты отдельных работ, выполненных на популяциях различного этнического происхождения, противоречивы и не позволяют однозначно ответить на вопрос о роли этих 8МР в развитии данной патологии [10—28]. В связи с этим представлялось целесообразным изучить ассоциацию полиморфных локусов генов фолатного цикла с риском РМЖ у этнических русских.
Цель нашей работы состояла в изучении роли полиморфных локусов С677Т (гв1801133) и А1298С (гз1801131) гена МТИЕЯ (метилентетрагидрофо-латредуктаза), С1420Т (^1979277) гена БИМТ1 (серин-гидроксиметилтрансфераза 1) и G1958A (к2236225) гена МТИЕБ (метилентетрагидрофолат-
дегидрогеназа) в формировании предрасположенности к развитию РМЖ в Западно-Сибирском регионе России. Нами проведен также мета-анализ, в который вошли результаты анализа ассоциации ряда SNP с РМЖ, а также данные, полученные в нашей работе.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реактивы. В работе использованы Tween 20 ("Serva"), додецилсульфат натрия, Трис, акриламид, ^^метиленбисакриламид, ТЕМЕД (все "ICN"); Taq-ДНК-полимераза (ИХБФМ СОРАН, Россия), эндонуклеазы рестрикции ("СибЭнзим", Россия), протеиназа К ("Serva"). Остальные реактивы были отечественного производства и имели категорию не ниже "х.ч.". Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), TaqMan-зонды и олигонуклеотидные праймеры синтезированы в ИХБФМ СО РАН.
Выборки. Выборка женщин со спорадической формой РМЖ и контрольная группа сформированы в рамках эпидемиологического исследования, проводимого Алтайским филиалом Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН. Все женщины были этническими русскими и проживали на территории Алтайского края РФ. В экспериментальную выборку вошли 850 женщин старше 45 лет (средний возраст — 55 ± 9 лет) с гистологически верифицированным диагнозом РМЖ. Контрольная группа состояла из 810 случайно отобранных из списка доноров крови женщин (средний возраст — 60 ± 16 лет) без онкопатологии. Все пациенты подписывали информированное согласие в соответствии с требованиями этического комитета.
Генотипирование. ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК с использованием смеси фенол—хлороформ и осаждение этанолом. Генотипы полиморфного локуса G1958A гена MTHFD определяли методом ПЦР-ПДРФ. ПЦР проводили в инкубационной смеси объемом 15 мкл, содержащей 65 мМ Трис-HCl (рН 8.9), 16 мМ сульфат аммония, 3.5 мМ MgCl2, 0.05%-ный Tween 20, 0.2 мМ dNTP, 0.2 мкМ растворы олигонуклеотидных праймеров MTHFD1 — tccat-accgttgaatgtgtggtc, MTHFD2 — ccaacaagcttgagtgcggtc, 20—100 нг ДНК и 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы, на ДНК-амплификаторе фирмы "Eppendorf" (Германия) с начальной денатурацией при 95°С в течение 3 мин, далее 38 циклов с денатурацией в течение 10 с при 95°С, отжигом праймеров (10 с при 63°С) и элонгацией (15 с при 72°С). Последнюю элонгацию проводили при 72°С в течение 5 мин. Продукты амплификации (169 п.н.) обрабатывали эндонуклеазой
рестрикции Bme18I. Длины фрагментов, получаемых в результате гидролиза, составляли 129 + 20 п.н. при генотипе G/G, 149 + 129 + 20 п.н. при генотипе G/A, 149 + 20 п.н. при генотипе A/A. Продукты гидролиза анализировали в 8%-ном полиакриламид-ном геле (ПААГ), гель окрашивали бромистым эти-дием с визуализацией в УФ-свете, затем фотографировали с помощью цифровой видеокамеры.
Полиморфные варианты генов MTHFR и SHMT1 выявляли методом ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зон-дов, комплементарных полиморфной нуклеотид-ной последовательности. ПЦР проводили в конечном объе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.