МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 4, с. 422-427
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.22.518
НЕГАТИВНОЕ ВЛИЯНИЕ АЛКИЛРЕЗОРЦИНОВ НА ПОДВИЖНОСТЬ РИЗОБАКТЕРИЙ Агозртиьим ВВАЗИЕЖЕ
© 2013 г. А. В. Шелудько*,1, А. В. Тугарова*, А. В. Ильчукова*, О. Э. Варшаломидзе*, Л. П. Антонюк*, Г. И. Эль-Регистан**, Е. И. Кацы*
*Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, Саратов **Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 06.11.2012 г.
Подвижность ризобактерий Л10$рт11ыт Ъгаяйете в жидких средах обеспечивается полярным жгутиком, в полужидких — наряду с полярным, и дополнительно синтезируемыми латеральными жгутиками. В присутствии 0.04—0.10 мМ 4-н-гексилрезорцина скорость плавания клеток штамма Л. Ъгаяйете $р245 существенно снижается, а при концентрациях данного алкилрезорцина, превышающих 0.10 мМ, бактерии полностью утрачивают подвижность. Наличие 4-н-гексилрезорцина в полужидкой среде также отрицательно сказывается на подвижности клеток штамма $р245 и других штаммов Л. Ъгаяйете ($р7, Сё и 8Я75). Концентрации 5-метилрезорцина, негативно влияющие на скорость распространения бактерий в полужидких средах, на порядок выше концентраций 4-н-гекси-лрезорцина, необходимых для достижения аналогичного эффекта. Высказано предположение о том, что алкилрезорцины, относящиеся к группе ауторегуляторов-алкилоксибензолов, действуют на клеточные механизмы (системы), обеспечивающие вращение жгутиков азоспирилл.
Ключевые слова: Azospirillum brasilense, подвижность, алкилрезорцины, 4-н-гексилрезорцин, 5-метил-резорцин, внеклеточные ауторегуляторы.
DOI: 10.7868/S0026365613040101
Бактерии рода Azospirillum из семейства Rho-dospirillaceae в естественных условиях обитают в основном на корнях высших растений, произрастающих в разнообразных климатических условиях [1, 2]. Интерес к изучению этих бактерий объясняется их способностью стимулировать рост широкого круга растений, в том числе, и агрономически значимых [1].
Перемещение азоспирилл в почве по направлению к корням растения и наличие у них чувствительной системы хемотаксиса, "настроенной" на определенные компоненты экссудатов предпочтительного партнера, обусловливают заселение бактериями данных растений [1]. Подвижность азоспирилл в жидких средах обеспечивает одиночный полярный жгутик, а их роение в полужидких средах — также и дополнительно синтезируемые многочисленные латеральные жгутики [1—3].
Обитание бактерий в ризосфере растений подразумевает воздействие на них различных внешних факторов, в том числе, и производных алкилоксибензолов (таких, например, как алкилрезорцины). Последние продуцируются растения-
1 Автор для корреспонденции (e-mail: shel71@yandex.ru).
ми и многими микроорганизмами и являются неспецифичными аутоиндукторами, обладающими широким спектром адаптогенных и регуляторных функций [4—6]. Алкилоксибензолы способны изменять метаболизм бактерий и индуцировать переход бактериальных культур в состояние покоя. Механизмы, обеспечивающие вышеуказанные эффекты, обусловлены, во-первых, взаимодействием алкилоксибензолов с мембранными липидами, что вызывает кристаллизацию липидной стромы мембран, ингибирование их функциональной активности, в том числе, энергопродуцирующих процессов, увеличение проницаемости мембран для моновалентных ионов и дегидратацию протопласта [7, 8]. Во-вторых, алкилоксибензолы функционируют как низкомолекулярные модификаторы, изменяющие структуру белковых макромолекул [9]. Действие данных аутоиндукторов на ризобактерии исследовано недостаточно, но показано, что алкилрезорцины содержатся в различных частях оболочки зерновок злаковых и обнаруживаются в корневых экссудатах [5, 6].
Целью настоящей работы было изучение влияния одного из классов алкилоксибензолов, алкил-резорцинов, на такой важный для формирования
ассоциаций с растениями аспект поведения A. brasilense как подвижность в средах разной плотности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы и условия культивирования бактерий.
Штаммы A. brasilense, использованные в работе, перечислены в таблице.
Бактерии культивировали на малатно-солевой среде (MSM) [13] при 30°С. При необходимости в среду добавляли Бакто агар до нужной концентрации.
В жидких средах бактерии выращивали в колбах Эрленмейера с использованием термостатируемой качалки (при 180 об/мин) или стационарно в термостате. В качестве инокулята использовали 18-часовую жидкую культуру бактерий, выращенную в тех же условиях, что и экспериментальная. Плотность бактериальных культур оценивали по стандарту мутности и вносили ее с таким расчетом, чтобы стартовая плотность экспериментальной культуры была 107 кл/мл. Алкилрезорцины 4-н-гексилрезор-цин и 5-метилрезорцин (орцин) ("Sigma", США), карбонилцианид-ж-хлорофенилгидразон (СССР) или амилорид ^-амидино-3,5-диамино-6-хлоропи-разинкарбоксамид) ("Sigma", США) вносили в среду вместе с инокулятом, используя их 1 М растворы (диапазон конечных концентраций этих соединений приведен в разделе Результаты и обсуждение). СССР и 4-н-гексилрезорцин растворяли в 96% этаноле; 5-метилрезорцин — в 50% этаноле; амилорид — в диметилсульфоксиде. Индикатор дыхательной активности микроорганизмов 2,3,5-трифенилтетразо-лий хлорид ("Fluka", Швейцария) вносили в среды до концентрации 50 мкг/мл.
Изучение подвижности бактерий в жидкой среде. Для изучения подвижности клеток бактериальные культуры выращивали в жидкой MSM в присутствии алкилрезорцинов, СССР или амило-рида. Скорость движения клеток определяли с использованием программы компьютерного анализа видеоизображения, как описано ранее [14].
Изучение подвижности бактерий в полужидких средах. Подвижность бактерий изучали на полужидких средах, содержащих 0.4% агара. В среды уколом бактериальной петли вносили микроорганизмы с плотной MSM. Морфологию зон распространения бактерий оценивали невооруженным глазом.
Определение численности жизнеспособных бактериальных клеток. Рост бактериальных культур оценивали по изменению оптической плотности (A590), которую регистрировали на спектрофотометре Spekol 221 ("Carl Zeiss", Германия). Численность жизнеспособных бактерий определяли методом подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ). При определении КОЕ из каждой пробы
Штаммы Azospirillum brasilense, использованные в работе
Штамм Характеристика Источник
Sp7 Дикий тип, выделен из ризосферы росички лежачей в Бразилии [2]
Cd Дикий тип, выделен из корней свинороя пальчатого после их инокуляции культурой А. brasilense $р7 в США [10]
Sp245 Дикий тип, выделен из корней пшеницы в Бразилии [11]
SR75 Дикий тип, выделен из проростков пшеницы в России [12]
готовили два параллельных ряда серийных разведений. Высевы производили на плотную MSM. Количество бактерий пересчитывали на 1 мл культуры.
Статистическая обработка результатов. Во всех случаях проводили не менее пяти независимых экспериментов. Все количественные результаты обрабатывали с использованием пакета статистического анализа Microsoft Office Excel 2003 (11.6355.6360) SP1. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Рост и подвижность A. brasilense в присутствии алкилрезорцинов. В жидкой среде клетки штамма A. brasilense Sp245 плавают при помощи полярного жгутика (Fla) прямолинейно со случайным изменением направления движения. Добавление к суспензии клеток 4-н-гексилрезорцина в диапазоне концентраций от 0.04 до 0.12 мМ не влияет на характер движения бактерий, но приводит к значительному уменьшению его скорости (рис. 1). Скорость плавания азоспирилл снижается уже через 1 мин после добавления гексилрезорцина (рис. 1). В присутствии 0.12 мМ гексилрезорцина подвижность клеток полностью подавляется (рис. 1). При более низких концентрациях гексилрезорцина (0.04—0.08 мМ) после 18 ч бактерии преодолевают стресс, и скорость их движения повышается, но не достигает контрольного уровня, а при концентрации 0.10 мМ и выше клетки азо-спирилл полностью обездвижены (рис. 1). Этанол, используемый для растворения гексилрезор-цина, не влиял на скорость движения клеток (к бактериальной культуре добавляли аликвоты этанола, равные аликвотам раствора ингибитора).
Для перемещения на агаризованных средах азоспириллам, помимо полярного жгутика, необходимы дополнительные латеральные жгутики, синтез которых индуцируется при концентрации агара от 0.4% и выше [3]. На полужидкой MSM с
Скорость движения клеток, мкм/с
Рис. 1. Влияние 4-н-гексилрезорцина на скорость движения клеток Л. Ъrasilense 8р245, выращенных в жидкой М8М в стационарных условиях. Длительность инкубации 1 мин (1), 18 ч (2) и 36 ч (3).
увеличением концентрации гексилрезорцина от 0.04 до 0.12 мМ наблюдается уменьшение диаметра колоний, образованных подвижными клетка-миЛ. ЪгазИете 8р245 (рис. 2). Наличие в полужид-
кой среде гексилрезорцина отрицательно сказывается на размере колоний, формируемых всеми исследованными штаммами Л. ЪгазИете'. 8р245, 8р7, Сё и 8Я75 (рис. 3). Данный эффект может являться следствием влияния алкилрезорцина как на подвижность азоспирилл, так и на рост бактериальной популяции.
Для оценки влияния гексилрезорцина на жизнеспособность азоспирилл бактерии выращивали в жидких средах стационарно. В 36-ч культуре Л. ЪгазИете 8р245, растущей в присутствии 0.10 мМ гексилрезорцина, количество КОЕ составляет (8.6 ± 1.0) х 105 кл/мл, что существенно ниже, чем в отсутствие гексилрезорцина ((1.5 ± 0.2) х 108 кл/мл). При более низких концентрациях гексилрезорцина (0.04, 0.06 и 0.08 мМ) количество КОЕ составляет соответственно (1.3 ± 0.2) х 108, (1.6 ± 0.2) х 108 и (1.2 ± 0.3) х 108 кл/мл, что близко к контрольному показателю. Таким образом, в течение 36 ч инкубации гексилрезорцин в диапазоне концентраций 0.04—0.08 мМ не влияет на рост Л. ЪгазИете 8р245, но оказывает одинаковое негативное влияние на скорость движения клеток при помощи полярного жгутика (рис. 1). Диаметр колоний азоспирилл на полужидких средах уменьшается с увеличением концентрации ингибитора. Изложенное позволяет полагать, что гексилрезорцин оказывает влияние и на функционирование латера
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.