ЗООЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 87, № 11, с. 1375-1381
УДК 599.742.7; 591.147
НЕИНВАЗИВНЫЙ МОНИТОРИНГ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ В ЭКСКРЕМЕНТАХ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО ЛЕСНОГО КОТА
(PRIONAILURUS BENGALENSIS EUPTILURUS)
© 2008 г. Е. В. Павлова, С. В. Найденко
Институт проблем экологии и эволюции РАН, Москва 119071, Россия e-mail: snaidenko@mail.ru Поступила в редакцию 27.08.2007 г.
Исследована возможность неинвазивного мониторинга уровня глюкокортикоидов в экскрементах дальневосточного лесного кота (Prionailurus bengalensis euptilurus) с использованием антител к кор-тизолу. Показана адекватность применяемого метода. Искусственная стимуляция выброса в кровь глюкокортикоидов путем инъекции адренокортикотропного гормона вела к увеличению уровня глюкокортикоидов в плазме крови через 1 ч после инъекции, а также иммунореактивных веществ в экскрементах животных. Выявлены четкие сезонные различия как в увеличении уровня глюкокортикоидов в экскрементах, так и в продолжительности временного интервала с момента инъекции АКТГ до появления пика иммунореактивных веществ в экскрементах. Предполагается связь этих различий с сезонными различиями в темпах метаболизма дальневосточных лесных котов. Отмечены индивидуальные различия реакции на инъекцию АКТГ.
Неинвазивные методы мониторинга глюкокортикоидов (ГЛ) в экскрементах животных приобретают все более широкое распространение. По сравнению с традиционными методами (в первую очередь - определением уровня ГЛ в плазме крови) они обладают рядом преимуществ (Miller et al., 1991; Герлинская, 1993; Palme, 2005). Сбор экскрементов (или других экскретов) обычно не оказывает влияния на поведение и гормональный статус животного. Кроме того, концентрация гормона в плазме крови претерпевает значительные суточные и ситуативные колебания. Концентрация же метаболитов гормонов в экскрементах является интегрированным показателем за определенный период времени, что несколько сглаживает подобные колебания и в значительной степени облегчает анализ данных. Регулярный сбор экскрементов у диких видов животных значительно проще методически, чем регулярные заборы крови. Однако при измерении ГЛ в экскрементах необходимо адаптировать методику для каждого отдельного вида, что связано с видовыми особенностями метаболизма гормонов (различными концентрациями иммунореактивных продуктов в фекалиях, а также видоспе-цифическим составом стероидных метаболитов и возможным искажением результатов в следствие кросс-реакций) (Mostl, Palme, 2002). Отдельный метаболит может служить надежным индикатором стресса у одного вида животных и, напротив, плохим - у другого (Palme et al., 1998; Goymann et al., 1999).
Для физиологического подтверждения адекватности неинвазивных методов гормонального мониторинга используются три основных подхо-
да. Первый, основанный на наличии достоверной корреляции между уровнем гормона в плазме крови и уровнем иммунореактивных веществ в экскретах (Dloniak et al., 2004), наиболее прост, но, пожалуй, наименее точен. Вторым способом является изучение последствий искусственного повышения (или, реже, понижения) уровня гормона в плазме крови посредством введения натив-ного гормона или стимуляции (либо подавления) естественного выброса его в кровь. В случае с гормонами надпочечников широко используется введение адренокортикотропного гормона (АКТГ) (Goymann et al., 1999). Появление соответствующего пика (или снижение уровня при подавлении экскреции) в экскретах позволяет определить возможность использования тех или иных антител для проведения измерений, а также определить временную задержку между изменениями концентрации гормона в плазме крови и экскрементах. Третий подход заключается во введении в кровь радиомеченного гормона, которое позволяет проследить не только временной интервал до начала экскреции гормона, но и то, в виде каких соединений гормон выводится из организма в экскретах и какие из них образуют комплексы гормон-антитела с антителами, применяемыми в исследовании (Wildt et al., 1988).
Методы неинвазивного мониторинга глюкокортикоидов (ГЛ) были разработаны для ряда видов диких кошачьих (Wildt et al., 1988). Как правило, они связаны с оценкой уровня ГЛ в экскрементах, так как у кошек более 80% ГЛ экскретируется из организма в фекалиях и лишь около 16-18% -в моче (Graham, Brown, 1996; Schatz, Palme, 2001). Вместе с тем, была показана возможность опре-
деления уровня ГЛ и в моче диких кошачьих (Carl-stead et al., 1992, 1993). У домашних кошек корти-костерон и кортизол секретируются надпочечниками в соотношении 1 : 4 (Bush, 1953). При этом неметаболизированные кортикостерон и кортизол в экскрементах практически отсутствуют (Graham, Brown, 1996). Поиск адекватных неинва-зивных методов для оценки уровня ГЛ привел к развитию двух основных подходов. Наиболее распространенный - использование антител к корти-костерону компании ICN для радиоиммунного анализа (Graham, Brown, 1996; Brown, 2006). Второй состоит в определении концентрации 11,17-диоксоандростанов (11.17-ДО А), одной из основных групп метаболитов кортизола в экскрементах целого ряда видов млекопитающих, в том числе и домашней кошки (Felis silvestris var. catus) (Schatz, Palme, 2001).
Недавно была показана возможность неинва-зиного мониторинга ГЛ и с использованием антител к неметаболизированному кортизолу у трех видов кошачьих: домашней кошки, гепарда (Acin-onyx jubatus) и дымчатого леопарда (Neofelis nebulosa), хотя кортизол в чистом виде у кошачьих в экскрементах практически отсутствует (или присутствует в минорных количествах) (Young et al., 2004). Последний метод в значительной степени упрощает и удешевляет анализ уровня ГЛ в экскрементах по сравнению с определением корти-костерона или 11,17-ДОА. Однако значительные видовые различия в метаболизме гормонов требуют валидации метода для каждого вида диких кошачьих. Целью настоящей работы была проверка возможности применения неинвазивных методов мониторинга ГЛ и активности ГГНС с использованием антител к кортизолу в экскрементах дальневосточного лесного кота (ДВК, Pri-onailurus bengalensis euptilurus Elliot) - представителя еще одного рода кошачьих.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Для физиологического подтверждения адекватности метода неинвазивного мониторинга ГЛ в экскрементах животных оценивали изменения концентрации иммунореактивных веществ, связывающихся с антителами к кортизолу, в экскрементах в ответ на инъекцию АКТГ, вызывающего выброс ГЛ в кровь и повышение уровня их метаболитов в экскретах. Работу проводили на научно-экспериментальной базе "Черноголовка" ИПЭЭ РАН в 2006 г. Семь половозрелых особей (три самки и четыре самца) дальневосточного лесного кота (Prionailurus bengalensis euptilurus) содержали поодиночке в вольерах площадью 48 м2 при естественном световом и температурном режиме. Каждая вольера была снабжена убежищем (деревянным домиком) размером 90 х 50 х 60 см. Животных кормили один раз в сутки мясом кур (около 0.5 кг на зверя), один день в неделю был
голодным. Животные имели неограниченный доступ к воде.
Эксперимент с инъекцией синтетического аналога АКТГ ("Synacten", 1 мг/мл, Novartis Pharma GmbH, Nürnberg) проводили дважды: зимой (январь-февраль) и летом (июль). АКТГ вводили внутримышечно в утренние часы (8.30-12.00; 0.25 мл/10 кг массы тела, что соответствовало 25 НЕ). В зимний период собирали все экскременты животных, выделившиеся в течение суток до инъекции гормона (день "0" - контроль) и в течение 6 суток после нее. При последующей обработке данных эти 6 сут были разбиты на 3 периода по двое суток в каждом, что было связано с низкой частотой дефекаций животных (2-3 раза в течение 6 сут после инъекции). Летом у всех животных перед инъекцией АКТГ и через 1 ч после нее были собраны образцы крови для последующего определения в них уровня кортизола. Экскременты собирали в течение 3 сут до и после инъекции. Сбор образцов летом проводили с короткими временными промежутками (до 6 ч), чтобы минимизировать время их нахождения на открытом воздухе. Собранные экскременты замораживали при температуре -18°С и хранили до проведения экстракции гормонов.
Экстракцию образцов проводили по описанной ранее методике (Jewgenow et al., 2006). На электронных весах "Ohaus" взвешивали 0.1 г экскрементов в пробирке Эппендорфа, добавляли 0.1 г трехвалентного оксида алюминия, а для начала экстракции - 0.9 мл 90%-ного метанола. Пробирки встряхивали на протяжении 30 мин при помощи перемешивающего устройства "Экрос", затем центрифугировали в течение 10 мин при скорости 4000 об/мин. В отдельную пробирку многоразовой пипеткой отбирали 200 мкл супер-натанта и добавляли 200 мкл дистиллированной воды. Полученные экстракты хранили при температуре -18°С до проведения измерений.
Определение уровня гормонов в экстракте и плазме крови проводили методом иммунофер-ментного анализа с использованием коммерческих наборов "НФА-Кортизол" компании Нмму-нотех (Москва, Россия). Нзмерения проводили на двух длинах волн - 450 и 620 нм. Каждое измерение проводили дважды для определения коэффициента вариации, а для дальнейшей обработки принимали среднее значение. При величине коэффициента вариации более 5% для данного образца проводили повторные измерения. Средний коэффициент вариации для образцов составил 3.9 ± 0.3% (n = 210), для контрольного образца с концентрацией 100 нг/мл, измеренного на разных пластинках - 13.4 ± 6.5% (n = 3) для кортизола. Коэффициенты регрессии для кривых связывания кортизола составили: стандартные растворы гормона = -1.970 ± 0.037, образцы экскрементов = = -2.040 ± 0.034, t = 0.139, p > 0.05 (t - критерий Стьюдента при сравнении коэффициентов регрессии кривых связывания стандартов и образ-
Концентрация ИРВ в экскрементах, мкг/г ± SE
3Г
АКТГ
Период
Рис. 1. Изменение концентрации иммунореактивных веществ (ИРВ), связывающихся с антителами к кортизолу, в экскрементах дальневосточного лесного кота (п = 7) в ходе проведения АКТГ-теста в зимнее время: 1-й период - 1-2-й дни после инъекции, 2-й период - 3-4-й дни, 3-й период - 5-6-й дни. Звездочкой (*) отмечены достоверные отличия ф < 0.05) концентрации ИРВ от так
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.