ОНТОГЕНЕЗ, 2015, том 46, № 2, с. 94-101
= КЛЕТОЧНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА
УДК 616-006-02:616-003.6:576.385.5
НЕКОТОРЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ САРКОМ, ИНДУЦИРУЕМЫХ
ИНОРОДНЫМ ТЕЛОМ
© 2015 г. О. В. Морозова, А. Ф. Карамышева, Т. Г. Мойжесс
НИИ канцерогенеза, Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, РАМН
115478 Москва, Каширское шоссе, 24 E-mail: 7012002@inbox.ru Поступила в редакцию 21.06.2013 г.
Окончательный вариант получен 13.03.2014 г.
Одним из вопросов, важных для понимания механизмов канцерогенеза, индуцируемого инородными телами, или "пластмассового" канцерогенеза, представляется вопрос о нормальных клетках-предшественниках сарком (ИТ-сарком), возникающих в непосредственной близости от имплантированной под кожу экспериментального животного пластмассовой пластинки. В литературе существует предположение о происхождении клеток-предшественников ИТ-сарком из клеток эндотелия сосудов, питающих соединительнотканную капсулу, образующуюся вокруг инородного тела. В нашей работе исследовалась экспрессия мРНК одного из маркеров клеток эндотелия — рецептора VEGFR2/Flk1 и взаимодействующего с ним фактора роста VEGF-A в предопухолевых клетках ИТ-сарком мыши. В исследуемых клетках обнаружена экспрессия мРНК VEGF-A, тогда как экспрессия мРНК VEGFR2/Flk1 в них отсутствовала. В свете этих и ранее установленных свойств клеток-предшественников ИТ-сарком обсуждаются возможности происхождения этих сарком из эндотелиальных клеток, перицитов и из полипотентных мезенхимальных стволовых клеток.
Ключевые слова: саркомы, индуцированные инородным телом; культуры предопухолевых клеток, экспрессия генов; УБОБ-А; УБО¥К2/¥1к1
DOI: 10.7868/S0475145015020056
ВВЕДЕНИЕ
Одним из вопросов, важных для понимания механизмов канцерогенеза, индуцируемого инородными телами, или "пластмассового" канцерогенеза, является вопрос о нормальных клетках-предшественниках сарком, возникающих в непосредственной близости от имплантированной под кожу экспериментального животного (крысы, мыши) пластмассовой пластинки (ИТ-саркомы). Главными подозреваемыми на роль предшественников этих опухолей представлялись фибробла-сты, из которых в основном состоит соединительнотканная капсула, образующаяся вокруг имплан-тата в течение месяца после его введения и существующая вплоть до образования опухоли. Действительно, при изучении гистологического типа ИТ-сарком различными авторами наряду со значительной долей малодифференцированных опухолей чаще всего назывались фибросаркомы, хотя встречались остео-, липо-, мезенхимомы и, редко, другие типы (см. обзор Мойжесс, 1981).
Однако, Джонсон и др. (Johnson et al., 1973) при изучении с помощью электронной микроскопии морфологических характеристик клеток
ИТ-сарком обнаружили, с одной стороны, в нескольких из 20 исследованных сарком участки с признаками различной (миксо-, остео-, лейо-мио-, фибро-) дифференцировки и одну геман-гиосаркому, а с другой — общие черты, характерные для эндотелия, перицитов и гладкомышечных клеток (аккумуляция в цитоплазме микрофила-ментов диаметром 60 Ä; наличие характерной ар-гирофильной межклеточной структуры типа ба-зальной мембраны; бедность коллагеновой продукции). На основании этих данных авторы пришли к заключению, что фибробласты не являются клетками-предшественниками этих опухолей и, учитывая гистологическое разнообразие возникающих ИТ-сарком, высказали предположение о существовании общих для них клеток-предшественников, обладающих "мезенхималь-ной плюрипотентностью" (полипотентностью по другой терминологии). На роль наиболее вероятных клеток-предшественников были предложены перициты.
В последующей работе (Johnson et al., 1980) авторы, изучая ультраструктуру клеточных типов культивируемых предопухолевых клеток с по-
верхности имплантированных пластинок и из окружающих их соединительнотканных капсул, также обнаружили их сходство с характеристиками эндотелиальных клеток и подтвердили свою гипотезу о происхождении ИТ-сарком из клеток, являющихся производными "примитивных клеток, ассоциированных с локальной микроваску-латурой".
Сходный взгляд на возможность происхождения эндотелия из полипотентных мезенхималь-ных клеток был распространен достаточно широко (Пожарисский и др., 1990). Этот взгляд нашел подтверждение в ряде недавних работ, в которых были обнаружены субпопуляции полипотентных стволовых клеток различной локализации, в том числе из местной адипозной ткани, способные в зависимости от условий культивирования дифференцироваться в разные клеточные типы, включая эндотелиальные клетки (Fischer et al., 2009; Janeczek Portalska et al., 2012; Culmes et al., 2013; Mihaila et al., 2013).
Ранее было показано (Brand et al., 1971; Мой-жесс, Пригожина, 1973), что среди клеток монослоя на поверхности имплантированной пластинки через 6 и более месяцев после имплантации присутствуют клетки-предшественники ИТ-сарком, поскольку при пересадке таких пластинок синген-ному реципиенту еще через 1—9 мес. у них возникают опухоли из клеток донора.
При культивировании клеток такого монослоя без признаков роста опухоли через 9 и 14 мес. с момента имплантации среди подавляющего большинства клеток макрофагального типа было выявлено присутствие клеток с мезенхимальной морфологией. Такие клетки обладали как рядом свойств, характерных для эндотелиальных клеток (способность к образованию монослоя типа cobblestone (булыжная мостовая) и капилляроподоб-ных структур при посеве на матригель) (Мой-жесс, 2010; Мойжесс, Васильев, 2013), так и свойствами, отличающими их от клеток нормального эндотелия (экспрессия a-SMA, характерная для гладкомышечных клеток и перицитов) (Мой-жесс, Александрова, 2000).
Поскольку обитающие на поверхности пластинок клетки-предшественники ИТ-сарком проявляли некоторые признаки, характерные для культивируемого эндотелия, представляло интерес дальнейшее изучение в этих клетках экспрессии маркерных генов клеток эндотелия.
Известно, что для клеток эндотелия характерна экспрессия рецепторов факторов роста эндотелия сосудов — VEGFR. Рецепторы VEGFR локализованы преимущественно на клетках эндотелия сосудов, и их экспрессия высоко специфична для этого типа клеток. Основным рецептором, через который передаются сигналы, регулирующие размножение и миграцию клеток эндотелия, считается VEGFR2 (гомолог рецептора VEGFR2 у
мыши — Flkl) (Ferrara et al., 2003; Matthews et al., 1991). В эмбриогенезе экспрессия этого рецептора является одним из наиболее ранних дифференци-ровочных признаков клеток эндотелия: VEGFR2 экспрессируется в гемангиобластах — клетках-предшественниках, являющихся общими для клеток эндотелия и стволовых клеток гемопоэза (Yamaguchi et al., 1993). В результате дальнейшей дифференцировки гемангиобластов в присутствии фактора роста VEGF-A образуются клетки эндотелия, в которых сохраняется экспрессия VEGFR2, а при отсутствии VEGF-A — стволовые клетки гемопоэза, в которых экспрессия рецептора VEGFR2 подавляется (Shalaby et al., 1995). В настоящее время экспрессия VEGFR2/Flk1 признана в качестве одного из основных маркеров клеток эндотелия (Smadja et al., 2007; Feng et al., 2011; Azhdari et al., 2013; Shojaei et al., 2013; Zhang et al., 2013).
Основной сигнальной молекулой, взаимодействующей с VEGFR2, является фактор роста эндотелия сосудов VEGF-A. Этот фактор экспрес-сируется клетками эпителия и мезенхимы, в том числе перицитами и гладкомышечными клетками. Эндотелиальные клетки также секретируют VEGF-A, хотя и в незначительных количествах (Maharaj et al., 2006; Moonen et al. 2010; TalaveraAdame et al., 2011). Предполагается, что невысокий уровень экспрессии этого фактора роста клетками эндотелия необходим для поддержания их выживаемости.
Целью данной работы было выяснить, экспрес-сируют ли клетки-предшественники ИТ-сарком мРНК рецептора VEGFR2/Flk,1 и взаимодействующего с ним фактора роста VEGF-А.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Пластинки из поливинилхлорида (пвх) размером 22 х 15 мм имплантировали под эфирным наркозом трехмесячным мышам СВА, самцам, по 1 пластинке под кожу каждого бока. Через 9 и 14 мес. пластинки извлекали; с каждой пластинки отдельно производили смыв клеток монослоя, покрывающего пластинку, в среду RPMI-1640 (ПанЭко, Москва) c 10% FCS (Standart Quality, PAA, Austria); (с гентамицином). Клетки выращивали на чашках Петри диаметром 10 см фирмы Corning Inc. USA. Спустя 10 суток клетки пассировали. Было получено несколько культур клеток с разных пластинок; 2 культуры- Ipl (после 9 мес. in vivo) и 1542 (14 мес. in vivo) — были клонированы. Полученные клетки выращивали в 2D (на пластике) и 3D (на матригеле) культуральных системах. Матригель (BD Biosciences) после размороз-ки разливали по 250 мкл в лунки 24-луночного планшета. Клетки рассевали по 1 х 105 на лунку.
Иммуногистохимическая окраска клеток. Для окрашивания клеток на a-SMA использовали
anti-a-SMA моноклональные антитела IgG2a мыши (Skalli et al., 1986). Клетки фиксировали метанолом 10 мин при —20°C, затем постепенно меняли метанол на фосфатный буфер. 1-е антитела: моноклональные мышиные антитела против a-SMA в разведении 1 : 100 наносили на препарат на 45 мин при комнатной температуре или на ночь при +4—6°C во влажной камере. Промывали фосфатным буфером 4 раза по 5 мин 2-е антитела: кроличьи анти-мышь конъюгированные с Alexa 647 (Jadson Immuno Research) наносили на 1 час при комнатной температуре во влажной камере. Промывали фосфатным буфером. Заключали в эльва-нол. После полимеризации последнего (ночь в 4— 6°C) просматривали и фотографировали на микроскопе Axioplan ("Zeiss", Germany) c камерой Olympus DP70, с объективами х20, х40.
Выделение РНК. Для выделения тотальной РНК из клеток и из ткани почек мышей-самцов линии СВА, использовавшихся в качестве положительного контроля, использовали реагент Tri-zol ("Sigma", USA), выделение РНК проводили в соответствии со стандартным протоколом фирмы "Sigma". Суспензию клеток гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с добавлением реагента Trizol из расчета 1 мл приблизительно на 1— 1.5 х 106 клеток. Кусочки ткани замораживали при темп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.