БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 2, с. 132-141
УДК 577.115:579.84:543.429.23
НЕКОТОРЫЕ ОСОБЕННОСТИ СОСТАВА НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ МОРСКОЙ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙ БАКТЕРИИ Chryseobacterium тйоШейсит С1Р 103168т
© 2007 г. Е. В. Воробьева1*, И. Н. Красикова1, А. С. Дмитренок1, П. С. Дмитренок1, А. Л. Дроздов2, А. В. Реунов1, Л. А. Лапшина1, Т. Ф. Соловьева1
1 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН 690022 Владивосток, просп. 100 лет Владивостоку, 159; факс: 7(4232)31-4050, электронная почта: piboc@stl.ru 2 Институт биологии моря ДВО РАН 690041 Владивосток, ул. Палъчевского, 17; факс: +7 (4232) 310 900,
электронная почта: inmarbio@mail.primorye.ru
Поступила в редакцию 29.09.2006 г.
Изучены особенности липидного состава наружной мембраны морской грамотрицательной бактерии Chryseobacterium indoltheticum С1Р 1031б8т. Показано, что клетки этой бактерии не содержат фосфатидилглицерин, из них традиционными методами экстракции не извлекается липополисаха-рид (ЛПС), а липид А, полученный гидролизом целых бактериальных клеток 10% уксусной кислотой с последующей обработкой смесью хлороформ : метанол, имеет необычную моносахаридную структуру и представляет собой 1-фосфат-О-глюкозамина, ацилированный остатками (К)-З-гидрок-си-15-метилгексадекановой и (К)-3-гидрокси-13-метилтетрадекановой кислот при С2- и С3-атомах соответственно. Установлено, что С. indoltheticum имеет капсулу, полисахарид которой, по-видимому, выполняет функции ЛПС.
Клеточная оболочка грамотрицательных бактерий (ГОБ) состоит из цитоплазматической (или внутренней) и наружной (НМ) мембран, которые разделены между собой периплазматическим пространством [1, 2]. В состав НМ кроме белков и фосфолипидов (ФЛ), типичных компонентов клеточных мембран, входят липополисахариды (ЛПС). ЛПС расположены во внешнем монослое НМ, ФЛ формируют ее внутренний монослой [3], благодаря чему НМ становится асимметричной, а ГОБ приобретают характерную для них устойчивость к действию веществ липофильной природы [4], в том числе гидрофобных антибиотиков [5]. В силу своего поверхностного расположения ЛПС играют важную роль во взаимоотношениях бактериальной клетки с окружающей средой, а в случае патогенных микроорганизмов - с организмом-хозяином, по отношению к которому они проявляют себя как О-антигены и эндотоксины [6].
Молекула ЛПС содержит липидный фрагмент, получивший название липида А (ЛА), к ко-
Сокращения: ГОБ - грамотрицательные бактерии; GlcN -глюкозамин; КПС - капсульныш полисахарид; Кдо - 3-дез-окси-а-^-манно-окт-2-улопиранозоновая кислота; ЛА -липид А; ЛХ - липид X; ЛПС - липополисахарид; МС -масс-спектрометрия; НМ - наружная мембрана; О-ПС -О-специфический полисахарид; ПЛ - полярные липиды; PCP - фенол : хлороформ : петролейный эфир; ФЛ - фос-фолипиды; ФЭ - фосфатидилэтаноламин; ФГ - фосфатидилглицерин.
*Адресат для корреспонденции: tikhonovaev@mail.ru
торому через олигосахарид, называемый кором, присоединяется так называемый О-специфиче-ский полисахарид (О-ПС), экспонированный во внешнюю среду [1, 7, 8]. Полисахаридная цепь ЛПС состоит из повторяющихся олигосахарид-ных звеньев различного состава и структуры [7, 9]. Длина О-ПС-участка молекулы ЛПС, которая определяется как морфологическими, так и генетическими особенностями штаммов бактерий, а также условиями их культивирования, может варьировать в широких пределах [6, 7, 10]. Мутант-ные микроорганизмы, формирующие шероховатые колонии (rough, R), синтезируют ЛПС R-типа, в молекулах которых отсутствует О-ПС-фраг-мент. Большинство ГОБ, выделенных из окружающей среды, образуют гладкие колонии (smooth, S) и продуцируют ЛПС S-типа с длинными О-спе-цифическими цепями.
ЛА выполняет функцию липидного якоря, удерживающего молекулы ЛПС в мембране, обеспечивает стабильность НМ, участвует в образовании барьера проницаемости бактериальных клеток. У многих бактерий, изученных к настоящему времени, ЛА представляет собой в-(1' —► 6)-дисахарид 2-амино-2-дезокси-^-глюкопиранозы (GlcN), фосфорилированный в положениях 1 и 4' и ацилированный остатками (К)-З-гидроксикислот в положениях 2, 3, 2', 3', которые в свою очередь замещены нормальными (негидрокси-) жирными кислотами, формирующими ацилоксиацильные группы [7].
НМ не всегда является самым внешним слоем бактериальной клетки, часто она бывает окружена довольно рыхлым слоем капсулы [11]. У многих бактерий капсула имеет углеводную природу и состоит из так называемых капсульных полисахаридов (КПС) [12, 13]. Показано, что КПС могут быть ассоциированы с О-цепями ЛПС [14], поэтому они часто экстрагируются вместе с ЛПС [15].
КПС довольно трудно отличить от ЛПС 8-фор-мы, потому что они представляют собой длинные разветвленные и неразветвленные гомо- и гетеро-полимеры, имеющие липидный якорь, который удерживает их на поверхности НМ. В качестве ли-пидного якоря для КПС может выступать ЛА [11] или какой-нибудь другой липид, например диацил-глицерофосфат [16]. Основной характеристикой, отличающей КПС от ЛПС, является длина их углеводных цепей: КПС длиннее ЛПС и обнаруживаются с помощью SDS-ПААГ-электрофореза только при окрашивании специальными красителями [15].
Настоящая работа посвящена характеристике липидных (ФЛ, ЛА) и полисахаридных (ЛПС, КПС) компонентов морской ГОБ Chryseobacteri-ит indoltheticum С1Р 103168т [17], принадлежащей к интенсивно изучаемому роду Chryseobacterium [18]. Интерес к бактериям этого рода обусловлен тем, что их химический состав имеет специфические особенности [19-21]. Показано, например, что они синтезируют довольно редкие нормальные и 3-гидроксиалкановые кислоты изо-серии [20-22], некоторые из них (С. defluvii [20], С. scoph-^а1тит С1Р 104199т [22]) не содержат фосфати-дилглицерин (ФГ). Из бактерий С. scophthalmum [22] выделен вид ЛА необычной моносахаридной структуры.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Условия культивирования бактерий. Клетки С. indoltheticum С1Р 103168т выращивали при комнатной температуре с интенсивным перемешиванием на жидкой питательной среде (20 л), как описано в работе [23]. Бактерии собирали на стационарной фазе роста (48 ч) центрифугированием (4000 g, 30 мин).
Выделение свободных липидов. Клетки последовательно промывали ацетоном, гексаном и смесью СНС13 : СН3ОН (2 : 1, по объему), проводя после каждой стадии центрифугирование (4000 g, 30 мин). Выходы высушенных на воздухе обезжиренных клеток и суммарной фракции липидов составили 0.86 г/л и 2.02 г (10.5% на вес сухих бактерий) соответственно. Липиды растворяли в минимальном объеме СНС13. К полученному раствору добавляли пятикратный объем холодного ацетона. После центрифугирования (4000 g, 30 мин) были получены фракции полярных (ПЛ, 1.36 г, 7.1%; осадок) и нейтральных (НЛ, 0.60 г, 3.1%; ацетоновый супернатант) липидов.
Выделение ЛПС. Процедура I. Обезжиренные клетки (2.7 г) обрабатывали горячим водным PhOH по методу Вестфаля [24]. Водную фазу отделяли центрифугированием (4000 g, 30 мин) и очищали от нуклеиновых кислот осаждением последних 40% (об/об) ТХУ на холоде с последующим центрифугированием. Супернатант диализо-вали против дистиллированной воды (до удаления ТХУ) и лиофильно высушивали (ЛПС-PW-I). Фе-нольную фазу диализовали против проточной (до удаления PhOH) и дистиллированной воды (после осаждения нуклеиновых кислот холодной 40% (об/об) ТХУ) и лиофильно высушивали (ЛПС-Ph-I).
Процедура II. Обезжиренные клетки (8.6 г) обрабатывали смесью PhOH (90%): CHCl3 : петро-лейный эфир (РСР) (5 : 5 : 8, по объему) [25]. Экстракт упаривали до полного удаления CHCl3 и петролейного эфира. К фенольному слою добавляли пятикратный объем ацетона. Выпавший осадок ЛПС-РСР-I отделяли центрифугированием. Клетки, оставшиеся после отделения РСР-экстракта, дважды промывали ацетоном и сушили на воздухе (5.2 г), после чего обрабатывали 45% горячим водным PhOH по методу Вестфаля [24], как описано в процедуре I (ЛПС-PW-II и ЛПС-Ph-II).
Выделение КПС [26]. 10 г влажных клеток суспендировали в 100 мл воды и интенсивно перемешивали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Охлажденную на ледяной бане суспензию клеток перемешивали 90 мин при комнатной температуре. Клетки отделяли центрифугированием (10000 g, 30 мин, 4°С). К супернатанту добавляли 40% ТХУ, центрифугировали, после чего КПС осаждали EtOH (2.5 объема, 24 ч, -20°С). Выпавший осадок КПС собирали центрифугированием (10000 g, 30 мин, 4°С), промывали EtOH и ацетоном. Часть осадка суспендировали в воде и лиофильно высушивали. Другую часть обрабатывали горячим водным PhOH [24]. В результате из водной и фенольной фаз были получены КПС-PW и КПС-Ph. Клетки, оставшиеся после отделения КПС, последовательно обрабатывали РСР-смесью [25] и горячим водным PhOH [24], как описано в процедурах II и I, чтобы получить ЛПС-PCP-II и ЛПС-PW-III соответственно.
Выделение липида А. Процедура I. ЛА получали гидролизом ЛПС (или КПС) 1% АсОН в течение 3-5 ч при 100°С [27]. После охлаждения выпавший осадок отделяли центрифугированием. Если в процессе гидролиза выпадения осадка не наблюдалось, гидролизаты обрабатывали смесью CHCl3 : MeOH (2 : 1, 30 мин, комнатная температура). Хлороформные экстракты промывали водой, сушили над безводным сульфатом натрия и упаривали.
Процедура II. ЛА получали гидролизом обезжиренных клеток (7 г) 10% АсОН (200 мл), как описано в работах [22, 28]. Выход ЛА составил 45 мг (0.65% на вес сухих бактерий).
Процедура III [29]. Обезжиренные клетки C. indoltheticum (15 г) суспендировали в физиологическом растворе (40 мл), затем добавляли концентрированную HCl (6.5 мл) и смесь СНС13 : МеОН (1 : 2, по объему; 150 мл). Суспензию интенсивно перемешивали на магнитной мешалке (60 мин, комнатная температура), после чего клетки отделяли центрифугированием (4000 g, 40 мин). К су-пернатанту добавляли по 150 мл воды и CHCl3. После расслоения нижнюю органическую фазу промывали водой и упаривали. В полученном препарате (200 мг, 1.3%) ЛА или его компоненты обнаружены не были.
Аналитические методы. Присутствие 3-дез-окси-а-.О-манно-окт-2-улопиранозоновой кислоты (Кдо) в образцах определяли с помощью тио-барбитуровой кислоты после предварительного гидролиза образц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.