БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 7, с. 1023 - 1039
УДК 547.917;577.114;577.115.4;577.352.2
НЕОГЛИКОЛИПИДЫ КАК ИНСТРУМЕНТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ГЛИКОБИОЛОГИИ И ГЛИКОМЕДИЦИНЕ
Обзор
© 2015 Е.Ю. Корчагина1, С.М. Генри2*
1 Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва,
ул. Миклухо-Маклая, 16/10; факс: +7(495)330-5592, электронная почта: korchagina@carb.ibch.ru, ellyu@yandex.ru
2 Технологический университет Окленда, факультет дизайна и современных технологий, Центр инновационных технологий KODEAUT, инженерное отделение, Прайвит Бэг 92006, Окленд, 1142, Новая Зеландия; электронная почта: shenry@aut.ac.nz
Поступила в редакцию 24.03.15 После доработки 14.04.15
Конструкции из функциональных липидов со спейсерной группой (function spacer lipid, FSL) представляют собой диспергируемые в воде амфифильные молекулы, способные самоассоциировать в клеточных мембранах или на твердых поверхностях. Модификация биологической или небиологической поверхности происходит быстро и достигается путем простого контакта поверхности с соответствующим буферным раствором, содержащим один или несколько видов FSL. Если функциональная концевая группа FSL является гликаном, формируются гликан-модифицированные поверхности. FSL-модифицированные клетки, вирусы и поверхности использовались как инструменты исследования in vitro и/или in vivo, в частности для исследования антител и лектинов. FSL нашли применение для картирования специфичности антител и нейтрализации антител/токсинов, а также в диагностических системах. FSL-модифицированные клетки использовались для иммунокорректировки и изучения трансфузионных реакций in vivo на моделях животных. FSL являются самым простым и быстрым методом модификации поверхности гликанами.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: функциональные липиды со спейсерной группой, технология KODE, кодециты, нео-гликолипиды.
Гликаны поверхности клеток существуют преимущественно в трех формах: ассоциированные с поверхностью незаякоренные глико-конъюгаты, заякоренные в мембране гликопро-теины (неподвижные гликаны) и мобильные мембраносвязанные гликаны, такие как глико-липиды и ОР1-связанные белки. Некоторые гликаны, ассоциированные с мембраной, могут одновременно присутствовать во всех трех формах, например, антигены групп крови могут
Принятые сокращения: FSL — функциональный липид со спейсерной группой; NGL — неогликолипид; CMG — карбоксиметилглициновая спейсерная группа; DOPE — 1,2-диолеил-от-глицеро-3-фосфоэтаноламин; НА — гиалуроновая кислота; F — функциональная концевая группа (функциональная «голова»); L — липидный «хвост»; S — спейсерная группа; ТСХ — тонкослойная хроматография; ИФА — иммуноферментный анализ. Сокращения гликанов приведены в табл. 1.
* Адресат для корреспонденции.
входить в состав муцинов, адгезированных на поверхности плазматической мембраны, а также присутствовать в мембране в составе заякоренных гликопротеинов и подвижных гликоли-пидов. Несмотря на то, что все типы ассоциированных с клеткой гликанов интересны с точки зрения проявления ими биологических функций [1, 2], данный обзор сфокусирован на синтезе и биологической активности только мобильных мембраносвязанных гликанов в форме синтетических гликолипидоподобных конструкций (неогликолипидов, МОЬ или функциональных липидов со спейсерной группой, Б8Ь).
Липидный «хвост» природного гликолипида обеспечивает ассоциацию гликана с клеткой — погружаясь внутрь, он заякоривает гликан в плазматической мембране [3, 4]. Такие молекулы либо распределяются равномерно, либо образуют кластеры, при этом ассоциируя с другими компонентами мембраны [5, 6]. Встроенные
гликолипиды имеют определенное время жизни в плазматической мембране — выходят в межклеточный матрикс (или в плазму крови); обратное явление тоже имеет место, т.е. неоглико-липиды могут быть захвачены из межклеточных жидкостей в плазматическую мембрану [3, 4]. Именно независимая («free-spirit») природа гли-колипидов сделала их идеальной моделью для разработки синтетических гликолипидоподоб-ных конструкций для модификации клеток гли-канами. В настоящее время используется несколько методов получения неогликолипидов. Одним из них является конъюгация восстанавливающих олигосахаридов с аминофосфолипи-дами посредством восстановительного амини-рования [7, 8]. Данная методология включает раскрытие моносахаридного кольца на восстанавливающем конце, что в ряде случаев оказывает влияние на биологическую активность гли-канов. Другим подходом к синтезу NGL является оксимное лигирование, которое заключается в конденсации восстанавливающих олигосаха-ридов с липидами, содержащими аминоокси-функциональную группу [9]. В составе полученных таким образом неогликолипидов обычно присутствуют как циклическая, так и ациклическая формы моносахарида на восстанавливающем конце, что приводит к неопределенности структуры NGL и химической нестабильности по отношению к гидролизу. Тем не менее такие NGL применяются в микроэррейных системах для идентификации новых биологически значимых гликолигандов [8, 9]. Идентичные природным синтетические гликосфинголипиды получают в результате многостадийного химического синтеза, они нашли применение для исследования углевод-углеводного и углевод-белкового взаимодействия в клеточной адгезии, при бактериальных и вирусных инфекциях, в воспалительном ответе и т.д. [10, 11]. Основным их недостатком является сложность конъюгации гли-кана с церамидным остатком. Сообщалось также о синтезе неогликолипидов, содержащих стерол, сдвоенные алкильные цепи или остатки высших спиртов в качестве липидоподобного агликона [12—14]. Однако такие NGL часто плохо растворяются в физиологическом растворе и требуют добавления растворителей (например, метанола) и/или других липидов для солюбили-зации перед встраиванием в мембрану [12].
Для преодоления вышеупомянутых ограничений мы разработали подход к созданию растворимых в воде неогликолипидов посредством присоединения гликанов к липидам через спей-серные группы — так называемых FSL-конструк-тов [15]. При разработке FSL мы руководствовались и другими критериями: FSL должны спон-
танно и воспроизводимо встраиваться в клеточные мембраны, а спейсерная группа и липид per se должны быть биологически инертными, чтобы обеспечить возможность использования FSL in vivo. Позднее было обнаружено, что FSL способны к самоассоциации в течение нескольких секунд на почти любой небиологической поверхности, включая металлы, пластик и бумагу, с образованием стабильного гликанового покрытия, сохраняющегося в плазме крови и не удаляющегося в процессе промывки буферными растворами, что значительно расширило область их применения [16].
СИНТЕТИЧЕСКИЕ ГЛИКОЛИПИДОПОДОБНЫЕ КОНСТРУКТЫ (FSL)
Огруктура FSL. Как показывает название, конструкт функционального липида со спей-серной группой (Р8Ь) состоит из трех компонентов: функциональной концевой группы («головы»), спейсерной группы и липидного «хвоста». Несмотря на то, что функциональная концевая группа играет ключевую роль как биологически активный компонент, спейсерная группа и липид также важны, обеспечивая встраивание в мембрану или ассоциацию на поверхности. Варьируя эти группы, можно конструировать множество вариантов при этом целенаправленно изменяя презентацию, ориентацию, дистанцирование от мембраны группы Е, что дает возможность влиять на биологическую активность в целом.
Функциональная концевая группа. Эта группа обычно является биологически активным компонентом в составе и может быть практически любой [17], но лучше гидрофильной для обеспечения амфифильности амфифиль-
ность способствует самоассоциации и спонтанному встраиванию в мембрану или процессу покрытия поверхности. Были синтезированы которые содержали в качестве функциональных групп гликаны, пептиды, белки, метки, флуорофоры, металлы, субстраты ферментов, хелатирующие агенты, олигонуклеотиды, химически реакционноспособные группы (в частности, для «клик-химии»), но в контексте данного обзора будут обсуждены только гликаны. Гликаны в диапазоне от моносахаридов до оли-госахаридов, вплоть до 100 моносахаридных остатков, были использованы для получения [15—19]. Хотя верхний предел размера гликана еще не установлен, слишком большая функциональная «голова» потенциально может мешать процессу встраивания/самоассоциации. Во из-
бежание этого для больших функциональных групп можно применить двухстадийный подход, при котором на первом этапе Б представляет собой реакционноспособную неуглеводную группу, которая может взаимодействовать с надлежащим образом модифицированным гликаном. Обычно используют с биотином в качестве функциональной «головы», которые могут затем «захватывать» биотинилированный гликан через авидиновый мостик [15]. Однако существуют и альтернативные подходы, например, использование с малеимидом, применение «клик-химии», субстрат-ферментного взаимодействия или хелатирующих агентов, при наличии соответствующим образом модифицированных гликанов.
Спейсерная группа. Спейсерная группа является той принципиальной составной частью которая отличает от природных глико-
липидов. Наличие спейсерной группы привносит дополнительные свойства, не всегда присущие природным гликолипидам, включая в некоторых случаях модулирование биологической активности гликана. Спейсерная группа делает более простой химию конъюгации липидного «хвоста» с функциональной «головой», но она также способствует растворимости в воде и дает возможность варьировать расстояние между гликаном и мембраной/поверхностью, что позволяет уменьшить стерические затруднения при представлении гликанов на поверхности. К настоящему времени синтезирован ряд простых и сложных вариантов (рис. 1), включая спейсеры разной длины, а также разветвленные и функ-ционализированные — для создания дополнительных биологических эффектов. Более длинные и мультивалентные спейсерные группы могут повысить чувствительность методов опреде-
Рис. 1. Структурные вариации спейсерных групп, использованных для получения Возможные функциональные концевые группы, относящиеся к каждому спейсеру (табл. 1), и липидные «хвосты» (рис.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.