ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.17:636.2
НЕРАВНОВЕСИЕ ПО СЦЕПЛЕНИЮ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ У ШЕСТИ ЛОКАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
© 2014 г. Т. Ю. Киселева1, J. Kantanen2, Н. И. Воробьев3, Б. Е. Подоба4, В. П. Терлецкий1
1 Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Российской академии сельскохозяйственных наук, Санкт-Петербург-Пушкин 196600
e-mail: tatk50@mail.ru
2 Biotechnology and Food Research, MTTAgrifood Research Finland, FI-31600 Jokioinen, Финляндия
e-mail: juha.kantanen@mtt.fi 3 Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук, Санкт-Петербург-Пушкин 196608
e-mail: nikolai_vorobyov@yahoo.com 4 Институт разведения и генетики животных Национальной академии аграрных наук Украины, Чубинское 08321
e-mail: bodryashova@ukr.net Поступила в редакцию 03.07.2013 г.
Аутосомальные микросателлиты широко используются для исследования генетической дивергенции, популяционной структуры и составления планов по сохранению наиболее ценных пород домашних животных. Нами проведен анализ неравновесия по сцеплению 29 микросателлитных маркеров у шести пород крупного рогатого скота: суксунская, истобенская, ярославская, холмогорская, серая украинская и печорский тип холмогорского скота. Выявлено достоверное неравновесие по сцеплению микросателлитов INRA037 и CSRM60 в популяции серого украинского скота.
DOI: 10.7868/S0016675814040043
Одна из главных задач в генетике сельскохозяйственных животных — идентификация генов, контролирующих хозяйственно-полезные признаки животных. Местные породы крупного рогатого скота могут обладать уникальными комбинациями аллелей, присущими только им, и быть важным резервом генетической вариабельности для коммерческих пород домашних животных. Почти все экономически важные показатели у домашних животных — количественные. Они определены совместным эффектом многих генов и факторами окружающей среды. Одним из наиболее перспективных методов для идентификации локусов, контролирующих сложные признаки, является метод полногеномного анализа ассоциаций. Установлено, что эффекты индивидуальных генов, отражающих хозяйственно-полезные признаки, могут быть определены через сцепление с генетическими маркерами [1—4]. С наличием полногеномного си-квенса и большого числа однонуклеотидных замен (8МР) у некоторых сельскохозяйственных видов животных стало возможным использование генетических маркеров с высокой плотностью для точного картирования генов количественных признаков ^ТЬ).
Существование неравновесия по сцеплению (LD) полагается на теорию, утверждающую, что есть короткие сегменты хромосом в популяции, которые длительное время передаются в поколе-
ниях без изменений от одного и того же общего предка. Ряд авторов сообщает о согласованности работы генов таких гаплотических блоков, которые пространственно размещены в различных районах генома человека, причем в разных популяциях согласованно могут работать различные гаплотипы [5—10]. Поэтому первым важным шагом в ассоциативном анализе является изучение неравновесия по сцеплению в популяциях. Сравнение и выбор нужных аллельных вариантов по генетическим характеристикам позволяет вести направленную эффективную селекцию у сельскохозяйственных животных.
Изучение неравновесия по сцеплению было проведено у человека [11, 12], в некоторых популяциях сельскохозяйственных животных [13—17] и птиц [18]. Показано, что у человека ЬЭ проявляется только в пределах коротких расстояний на хромосоме, в среднем 24 тпн. Такое заболевание, как сахарный диабет типа 1, связано с наследованием определенных аллелей обычных "здоровых" генов разных локусов. Только наличие определенной комбинации этиологических вариантов в генах, предрасполагающих к заболеванию, может приводить к физиологическим нарушениям, находящим свое выражение в развитии сахарного диабета типа 1 [19].
Неравновесие по сцеплению зависит от ряда факторов: генетического дрейфа, селекции, мутаций, эффективной численности популяций [20, 21]. Генетический дрейф оказывает большее влияние на неравновесие по сцеплению в популяциях с небольшой эффективной численностью. Эффективная численность популяций оказывает влияние на величину ЬЭ: чем меньше эффективная численность популяций, тем больше ЬЭ. В молочном скотоводстве широкое распространение искусственного осеменения при небольшом количестве элитных быков привело к уменьшению эффективной численности популяций. Мутации приводят к неслучайной ассоциации между аллелями разных локусов. Если с мутацией, вызывающей заболевание, рядом находится маркерный аллель, то этот аллель будет наследоваться с мутацией в ряду поколений, пока рекомбинация не нарушит их сцепление. Для тесно сцепленных локусов неравновесие может существовать длительное время, особенно в малых популяциях, где рекомбинация контрбалансируется генетическим дрейфом.
Популяции крупного рогатого скота имеют малую эффективную численность (100—200 голов) и очень большие семьи, что влечет за собой увеличение неравновесия по сцеплению на расстояниях до нескольких десятков сантиморганид. Для популяций крупного рогатого скота молочного направления показано как внутрихромосом-ное неравновесие по сцеплению до ~20 сМ, так и межхромосомное ЬЭ [22]. Сравнительные карты неравновесия по сцеплению позволяют исследовать степень дивергенции между породами крупного рогатого скота.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Всего было проанализировано 238 животных от шести различных локальных популяций крупного рогатого скота по 30 микросателлитным маркерам (ВМ1824, ВМ2113, ВМ1818, С8ЯМ60, С88М66, ЕТН3, ЕТН10, ЕТН152, ЕТН185, ЕТН225, НАиТ24, НАиТ27, НЕЬ1, НЕЬ5, НЕЬ9, НЕЬ13, ШЯА023, ШЯА032, ШЯА035, ШЯА037, ШЯА063, 1Ь8Т8005, 1Ь8Т8006, ММ12, ШЯА005, 8Р8115, TGЬA227, TGЬA126, TGЬA122, TGLA53). Образцы крови крупного рогатого скота были взяты в следующих областях России и Украины:
1. Холмогорская — с. Холмогоры, Архангельская область.
2. Печорский тип холмогорского скота — г. Ухта, Республика Коми.
3. Серый украинский скот — Борис польский район, Украина.
4. Истобенская — Оричевский район, Кировская область.
5. Суксунская — Суксунский район, Пермская область.
6. Ярославская — Тутаевский район, Ярославская область.
ДНК от животных выделяли во ВНИИГРЖ (Пушкин) и в Институте молекулярной биологии и генетики НАН Украины (Киев). Концентрацию выделенной ДНК измеряли на приборе GeneQuant фирмы Pharmacia Biotech (Швеция). Концентрацию ДНК доводили до 10 нг/мкл пропорциональным добавлением деионизированной воды, концентрацию праймеров — до 10 пмол/мкл. Нуклеотидные последовательности праймеров и их локализация на хромосомах [23—36] приведены в табл. 1. Анализ микросателлитов с резко различающимися длинами аллелей проводили по парам. Результаты ПЦР проверяли в 6%-ном по-лиакриламидном геле. Измерение длин микросателлитов проводили на приборах ALF Express automated DNK sequencer (Pharmacia, Швеция) и MegaBACE™ 500 DNA Sequencer ( Amersham Biosciences). Точная длина аллеля определялась путем сопоставления с длинами аллелей маркерных животных, приведенными в таблице международных стандартов. В результате получали графики и по расположению пиков определяли длину микросателлита в нуклеотидных парах. Для статистического анализа была использована программа GDA, где тестирование на генетическое равновесие по Харди—Вайнбергу и неравновесие по сцеплению парных локусов проводилось с помощью точного критерия Фишера с микросателлитами, имеющими не более четырех аллелей ^-значения без ошибки), и с использованием цепи Маркова с микросателлитами с пятью и более аллелями (p-значения с ошибкой). В тесте на LD использовали 10000 пермутаций.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для получения правомерных результатов на неравновесие по сцеплению генетических маркеров необходимо проводить анализ распределения генотипов каждого отдельного локуса. Если генетическое равновесие локуса в популяции значительно отклоняется от теоретически ожидаемого по Харди—Вайнбергу, этот локус нельзя использовать для анализа неравновесия по сцеплению [37]. Статистический анализ множественных аллелей предполагает использование поправки Бонферрони, которая определяет новые, более жесткие уровни значимости. Так, при 30 локусах критический уровень значимости индивидуальных тестов должен быть не больше, чем 0.001667, чтобы считаться значимым на уровне 0.05% (0.05 : 30 = = 0.001667, табл. 2 и 3).
С учетом поправки Бонферрони микросателлит INRA035 показал достоверные отклонения
Таблица 1. Хромосомная локализация и сиквенс праймеров 30 микросателлитных локусов крупного рогатого скота
Микросателлит Номер хромосомы Сиквенс праймеров (5'—3') Ссылка на литературу
ВМ1824 1 аАОСААааТОТТТТТССААТС САТТСТССААСТОСТТССТТО [23]
ВМ2113 2 ОСТОССТТСТАССАААТАССС СТТССТОАОАОААаСААСАСС [23]
ЕТН10 5 ОТТСАООАСТООСССТОСТААСА ССТССАОСССАСТТТСТСТТСТС [24]
ЕТН225 9 ОАТСАССТТОССАСТАТТТССТ АСАТОАСАОССАОСТОСТАС [25]
ЕТН3 19 аААССТОССТСТССТОСАТТаа АСТСТОССТОТООССААОТАОО [24]
НЕЬ5 21 ОСАООАТСАСТТОТТАОООА АОАСОТТАОТОТАСАТТААС [26]
1Ь8Т8005 10 ООААОСААТОАААТСТАТАОСС ТОТТСТОТОАОТТТОТААОС [27]
ШЯА023 3 ОАОТАОАОСТАСААОАТАААСТТС ТААСТАСАОООТОТТАОАТОААСТС [28]
ШЯА005 12 СААТСТОСАТОААОТАТАААТАТ СТТСАООСАТАСССТАСАСС [29]
ШИА063 18 АТТТОСАСААОСТАААТСТААСС АААССАСАОАААТОСТТООААО [28]
ВМ1818 23 АОСТааОААТАТААССАААаа АОТОСТТТСААООТССАТОС [23]
СЗЗМ66 14 АСАСАААТССТТТСТОССАОСТОА ААТТТААТОСАСТОАООАОСТТОО [30]
ЕТН152 5 ТАСТСОТАОООСАООСТОССТО ОАОАССТСАОООТТООТОАТСАО [25]
НЕЬ1 15 СААСАОСТАТТТААСААООА АООСТАСАОТССАТОООАТТ [26]
НЕЬ13 11 ТААООАСТТОАОАТААООАО ССАТСТАССТССАТСТТААС [26]
НЕЬ9 8 СССАТТСАОТСТТСАОАОаТ САСАТССАТОТТСТСАССАС [26]
1Ь8Т8006 7 ТОТСТОТАТТТСТОСТОТОО АСАСООААОСОАТСТАААСО [31]
ШЯА032 11 АААСТОТАТТСТСТААТАОСТАС ОСААОАСАТАТСТССАТТССТТТ [28]
ШЯА037 10 ОАТССТОСТТАТАТТТААССАС ААААТТССАТООАОАОАОАААС [28]
ТОЬА227 18 СОААТТССАААТСТОТТААТТТОСТ АСАОАСАОАААСТСААТОАААОСА [32]
ТОЬА126 20 СТААТТТАОААТОАОАОАООСТТСТ ТТООТСТСТАТТСТСТОААТАТТСС [32]
ТОЬА122 21 СССТССТССАООТАААТСАОС ААТСАСАТООСАААТААОТАСАТАС [32]
НАиТ24 2
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.