ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.17:599.323.4
НЕСОГЛАСОВАННОСТЬ РАСПРОСТРАНЕНИЯ МАРКЕРОВ РАЗНЫХ СИСТЕМ НАСЛЕДОВАНИЯ (я-, мтДНК И ХРОМОСОМЫ) В НАДВИДОВОМ КОМПЛЕКСЕ Mus musculus КАК СЛЕДСТВИЕ ОБШИРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ В ПРИМОРЬЕ © 2011 г. Л. Н. Спиридонова, К. В. Киселев, К. В. Коробицына
Учреждение Российской академии наук Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения РАН, Владивосток 690022; e-mail: spiridonova@biosoil.ru Поступила в редакцию 27.02.2010 г.
Исследована генетическая структура восьми популяций Mus musculus L. Приморского края с использованием таксон-специфичных маркеров разных систем наследования: яДНК (RAPD), мтДНК (D-петля) и хромосомы. В результате исследования оказалось, что сравниваемые ядерные маркерные признаки (яДНК и хромосомы), хотя и имеют одну и ту же основу, не связаны между собой и, более того, часто противоречат друг другу. Несогласованность наследования маркерных признаков у большинства исследованных особей является следствием обширной гибридизации, в которой участвуют от двух до четырех подвидов домовой мыши. Для идентификации таксон-специфичных ядерных признаков, выявленных методом RAPD, проведено их клонирование и секвенирование, установлены места их локализации на хромосомах. Показано, что некоторые сходные по размеру фрагменты состоят из двух разных ко-мигрирующих последовательностей, которые локализованы на различных хромосомах и принадлежат разным подвидам. Все секвенированные анонимные признаки локализованы в белок-кодирующих генах. Установлено функциональное значение генов, в состав которых входят маркерные последовательности. Отличия в таксон-специфичных RAPD-фрагментах связаны с изменениями в структуре важных функциональных генов и это можно отнести к значимым генетическим маркерам.
Гибридные зоны предоставляют уникальный материал для исследования микроэволюционных процессов в природных популяциях. Генетические аспекты гибридизации и сами гибридные зоны животных и растений в большинстве случаев изучены недостаточно. Для некоторых видов насекомых, птиц и грызунов показано, что в случаях гибридизации таксон-специфичные характеристики разных систем наследования (хромосомные, ядерные и митохондриальные) распределяются по ареалу не одинаково [1—7]. Результаты по разным молекулярным маркерам часто не согласуются как между собой, так и с морфологическими данными [8—10]. Некоторые исследования указывают на более быструю интрогрессию мтДНК по сравнению с ядерными генами [1—3, 11]. Подобное явление подчеркивает необходимость параллельного анализа яДНК, мтДНК и хромосом для изучения генетической структуры популяций, в особенности в зонах гибридизации [6, 12]. Современные молекулярно-генетические методы позволяют в ряде случаев выявить скрытую (не проявленную фенотипически) гибридизацию, определить и направление интрогрессии тех или иных генов, установить генетическую дискретность таксонов, а использование нескольких ти-
пов маркеров существенно повышает информативность результатов [9, 13].
Одним из примеров животных, обладающих межподвидовой гибридизацией, является домовая мышь Mus musculus Linnaeus, 1758. Применение современных генетических методов привело к пересмотру ее систематики по всему ареалу. Надвидовой комплекс M. musculus хорошо изучен на территории Евразии, особенно в европейской части, в Закавказье и Японии, где находятся зоны гибридизации его разных форм. Восточноазиат-ская часть ареала M. musculus на территории России интенсивно изучается на уровне биохимических, хромосомных, митохондриальных маркеров, ПДРФ яДНК [14—19]. Однако результаты по разным типам маркеров для одних и тех же животных часто не совпадают, что приводит к противоречиям при их сравнении. Следовательно, описание популяционной структуры по одному типу маркеров не отражает действительного генетического разнообразия в зонах гибридизации подвидов домовой мыши и для повышения надежности результатов необходимо использование нескольких независимых генетических характеристик [12].
115
8*
Поиск адекватных таксон-специфичных генетических признаков разных систем наследования и их корреляция друг с другом представляет трудную задачу, осложняющуюся явлениями гибридизации изучаемого надвидового комплекса. На территории Дальнего Востока, и в особенности Приморья, домовая мышь в этом отношении представляет собой уникальный объект, поскольку здесь одновременно участвуют в гибридизации от двух до четырех ее подвидов [18, 19 и мн. др.]. Синантропность и способность расселения любыми транспортными средствами, характерные для этих животных, не только размыли "условные" географические границы подвидовых ареалов на Дальнем Востоке, но и значительно перемешали генетические характеристики у каждой отдельно взятой особи. Большинство исследуемых нами точек служат переходными пунктами в перемещении домовых мышей с территорий соседних государств и обратно, а животные из этих точек имеют наибольшую генетическую изменчивость [4].
Основной целью нашей работы стала попытка разрешения вопроса о таксономическом соответствии маркеров разных систем наследования друг другу. Настоящая работа представляет собой обобщение результатов многолетних исследований популяций домовой мыши Приморского края (1998—2006 гг.), полученных с использованием разных молекулярно-генетических подходов на одних и тех же образцах. Задачей исследования стало сравнение по разным таксон-специфичным признакам (я-, мтДНК и хромосомы) каждого отдельно взятого животного для выяснения достоверной картины генетической структуры популяций домовой мыши в условиях обширной гибридизации в Приморье. В предыдущих работах, используя произвольные праймеры, мы выявили низкую молекулярно-генетическую дифференциацию подвидов домовой мыши (значения DN изменялись от 0.09 до 0.14), однако нам удалось обнаружить таксон-специфичные для подвидов M. musculus КЛРЭ-фрагменты [4]. Поскольку этот тип признаков имеет статус анонимных последовательностей и используется с осторожностью, то для идентификации некоторых обнаруженных ЯЛРЭ-маркеров и определения мест размещения их на хромосомах, а также установления функционального значения было проведено их клонирование и секвенирование.
В нашей работе впервые предпринята попытка объединить разные типы таксон-специфичных признаков для данного объекта и дать полную картину генетической структуры популяций домовых мышей Приморья. В результате этого исследования оказалось, что сравниваемые признаки, хотя и имеют одну и ту же основу (яДНК и хромосомы), не связаны между собой и, более того, часто противоречат друг другу. Мы попыта-
лись с помощью методов клонирования и секве-нирования найти связь между разными типами маркеров, что в дальнейшем может быть использовано для более корректного выбора подвидовых характеристик ядерного и хромосомного уровней.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы животных и выделение ДНК. Материал для исследования представлен 75 образцами из 8 точек Приморья (таблица). Кроме того, в работе использован материал, любезно предоставленный д-ром Х. Сузуки (Тайвань — 1 обр. castaneus; Япония, институт RIKEN — 2 обр. domesticus), д-ром К. Аплином (Бангладеш, Мьянма — 4 обр. castaneus,), проф. Тсучией (Непал — 2 обр. bactri-anus).
ДНК получали солевым методом из печени, фиксированной в 70%-ном этаноле [20].
RAPD-анализ. Для обнаружения ядерных под-видоспецифичных маркеров в анализируемых популяциях были применены ранее подобранные шесть десятинуклеотидных случайных прайме-ров ("Fasmac", Япония) с различной последовательностью и 60-70%-ным содержанием (G + C) пар. PCR проводили по описанной ранее методике [4]. Для получения достоверной повторяемости амплификации маркерных фрагментов было проведено от 2 до 4 PCR-реакций. RAPD-продук-ты разделяли электрофорезом в 2%-ном агароз-ном геле с использованием 1хкрасителя GelRed ("Biotium"), в 0.5 х TBE-буфере и анализировали в гель-документирующей системе "BioRad" (США). В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК-маркер М26 (Сибэнзим, Россия).
Клонирование и секвенирование RAPD-маркеров проводили на базе Юннаньского университета и Института зоологии Куньминя АН Китая, пров. Юн-нань, и частично — на базе БПИ ДВО РАН. Маркерные фрагменты были извлечены из 1%-ного агарозного геля и очищены с помощью набора QIAGEN (для выделения ДНК из агарозных гелей) по методике производителя. Всего было очищено семь 0РС-071200-фрагментов для castaneus (n = 5) и bactrianus (n = 2), а также два 0PC-071010-фрагмента для domesticus (n = 2), которые использовались для клонирования. ТА-клонирование RAPD-фрагментов проводили с помощью набора "TaKaRa" (Япония) согласно инструкции производителя. Для легирования использовали вектор pMD18-T Трансформацию проводили в компетентные клетки E. coli штамма DH5a. Было отобрано от 6 до 10 клонов для каждого фрагмента. В целом проанализирован 71 клон. Для проверки клонов на предмет наличия вставки использовали праймеры B0012 (5'-CGCCAGGGTTTTC-CCAGTCACGAC-3') и B0013 (5'-AACAGCTAT-
Распространение подвидовых маркеров я-, мтДНК и кариотипов M. musculus
№ п/п Место сбора материала № образцов яДНК мтДНК Карио- 3 тип3 № п/п Место сбора материала № образцов яДНК мтДНК Карио- тип3
1 2 3 Хасан, Хасанский р-н (п = 6) 724 726 744 mus mus mus mus1(R) musx(R) mus1(R) gans gans mus 42 43 44 Иннокен-тьевка, Лесо-заводской р-н (п = 13) 792 793 794 dom mus dom mus1 dom1 dom1 mus cas (dom?) mus
4 745 cas musl(R) gans 45 795 dom 2 mus cas (dom?)
5 746 cas cas X(R) mus (cas?) 46 796 mus 2 mus mus
6 758 cas musl(R) gans 47 797 dom mus1 mus
7 8 9 Краскино, Хасанский р-н (п = 9) 725 729 730 mus x cas mus x cas mus x cas mus mus mus gans x cas gans x cas gans x mus 48 49 50 798 799 800 dom mus dom mus1 mus2 dom1 mus mus mus
10 731 mus x cas mus - 51 801 dom dom1 cas (dom?)
11 733 mus x cas mus mus 52 802 dom dom1 cas (dom?)
12 736 mus x cas mus cas 53 803 dom mus1 -
13 737 mus x cas mus mus x cas 54 804 mus 2 mus2 mus
14 15 738 739 mus x cas mus x cas mus mus gans mus x cas 55 56 Пограничный, Пограничный р-н (п = 8) 805 806 gans gans x cas mus1 mus1 mus x ca
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.